三七素檢測方法研究進展淺談

孫麗麗

哈藥集團世一堂制藥廠 150000

三七素檢測方法研究進展淺談

孫麗麗

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在中藥三七中，其中的一個主要成分是三七素，三七素具有止血的成分，這種成分在山黧豆中居多，因此三七素又被稱為是山黧豆神經毒素，本文重點對三七素的主要檢測方法進行了研究，希望能夠對今后的工作有所幫助。

三七素；液相色譜；流動注射

在山黧豆中，能夠檢測出三七的成分，最早人們并沒有對三七素具有全面的了解，而是集中在神經中毒方面的研究，這是一種古老的豆類成分，具有耐旱性的特點，在歷史上曾經出現過幾次中毒事件，因此山黧豆的種植數量逐年遞減。我國對于山黧豆的種植已經很少了，因為其耐旱的特點，所以地域較為干旱的地區還是有所種植的，比如西北地區、印度以及埃塞俄比亞等。為了專門探究山黧豆中毒的原因，印度最早開始了這方面的研究工作，在其中鑒定出了三七素，三七素具有止血的活性，在神經毒方面也具有一定的作用，但是這兩個方面的復雜功效來看，還需要加以進一步的研究，只有這樣才能將其應用在更加有用的領域中。

1、傳統的檢測方法

在對三七素進行檢測的過程中，合理的檢測方法十分重要，每種檢測方法都各有特點，下面筆者就簡單的介紹了幾種檢測方法。首先是傳統的檢測方法。三七素屬于氨基酸的一種，在最早的檢測過程中，主要是采用對氨基酸的通用方法，例如紙電泳以及薄層層析等方法，在這種情況下，使用茚三酮能夠顯示出顏色，再對其進行測量。傳統的，高效薄層層析法能夠對不同三七頭中的三七素含量進行測量，并且得出三七素基本含量為 0.316%左右。還有一種檢測方法為“Rao法”，在檢測的過程中首先是要將三七素在水中進行水解，然后得出相應的產物，在乙硫醇中進行反應，得到有色復合物，在420nm下進行對比測定三七素的最終含量。這些都是傳統的檢測方法，但是不足之處在于靈敏度相對較低，準確度也不高。

2、高效液相色譜檢測法

2.1 間接（衍生化）檢測法

首先介紹的是一種間接檢測法，在上世紀80年代出現了對氨基酸進行自動分析的儀器，這是在離子交換層析基礎上實現的一種檢測方法。隨著時代的發展，這一儀器得到了更加大范圍的使用，尤其是在對山黧豆中的三七素進行檢測的過程中，可以很好的對其進行測量，隨即又開發了全新的測量方法，就是使用柱后衍生化顯色法，這種方法主要是以高效液相色譜為基礎的一種方法，同時也應用了紫外線等一些手段，在檢測的過程中，靈敏度得到顯著的提升，并且時間也得到了有效的控制，尤其是在分析的過程中，效果是十分明顯的。

在使用這一檢測方法的過程中，過去都是在 340nm的環境下進行紫外線檢測的，或者是使用熒光檢測器進行檢測，其作用在于能夠解決衍生物不穩定的現象，在此基礎上使用 9芴基甲氧基碳酰氯作為主要的衍生試劑，在熒光下對三七素進行檢驗，針對這一檢測方法，相關人員對幾種不同的三七頭進行了提取，檢驗其中三七素的含量，得到結果是在0.565%～0.609%之間，9—芴基甲氧基碳酰氯具有反應迅速的特點，得出的產物也相對穩定，但是無法將兩個異構體明顯的區分開來，因此使用異硫氰酸苯酯代替原有衍生試劑，得出了更好的效果，通過采用間接（衍生化）檢測法對相關成分進行分析可以得知，效果要比原有的衍生試劑要好。

2.2 直接檢測法

除芳香族氨基酸外，大多數氨基酸在近紫外區（200～400nm）無吸收，所以不能直接用紫外檢測器測定其含量，但三七素分子中含有草酰基團，而草酸本身有紫外吸收，國內有不少學者利用 HPLC在210nm左右的紫外區直接檢測生物樣品中草酸的含量。由此推測，在210nm附近檢測三七素應源于其分子中的草酰基團，在213nm紫外區用HPLC比較詳細地分析了三七不同組織中三七素的含量，結果發現云南文山三七中三七素含量（以干重計）比其他產地高，含量范圍在0.42%～0.62%之間；花蕾?莖葉?根莖?主根?側根和須根的含量分別是0.86%?0.37%?0.88%?0.52%?0.41%和0.89%。利用離子對反相HPLC在220nm下分析了云南不同規格三七頭中的三七素含量（以干重計），范圍在0.561%～0.582%之間。在214nm下檢測并分離純化三七中的三七素。在213nm下利用HPLC法測定了三七片中的三七素含量，范圍在0.428%～0.435%之間。在213nm處檢測發現三七商品規格中“無數頭”的三七素含量最高，可達1.02%，而“13頭”至“120頭”中的含量在0.52%～0.69%之間。利用HPLC在213nm紫外檢測建立了三七頭和三七總皂苷提取廢液中三七素含量的分析方法。

2.3 流動注射檢測法（FIA）

流動注射分析法檢測三七素的原理是在恒流泵驅動的載體流中注射待測樣品，經過反應器時，三七素發生特異性的反應，捕捉反應物的光吸收信號實現對三七素的間接定量。首先用 FIA法通過谷氨酸氧化酶催化三七素氧化分解檢測山黧豆樣品中的三七素含量。谷氨酸氧化酶能低效率地分解三七素（催化活性僅僅是谷氨酸的0.8%），這主要是由于三七素與谷氨酸在分子結構上比較相似（分子未端都有一個羧基）。谷氨酸氧化酶氧化分解谷氨酸和三七素時都能釋放出 H2O2，后者在過氧化物酶（通常使用辣根過氧化物酶）催化下氧化還原性染料使其變色。實際檢測時一般用兩個反應器，第一個用谷氨酸氧化酶先破壞樣品中可能存在的大量谷氨酸，第二個反應器中檢測谷氨酸氧化酶氧化分解三七素時釋放出的 H2O2。為提高檢測靈敏度，對該方法進行了大量改進，但至今仍未開發出能實際應用的谷氨酸氧化酶傳感器。

3、討論

綜合上述的一些檢測方法可以得知，隨著時代的發展與進步，相應的檢測方法會更加完善，從最早的傳統檢測方法算起，三七素的檢測已經經歷了一段較長的時期，并且檢測的方法還會更加高效與節省時間。三七素是一種重要的三七藥效成分，探索三七素的生物活性甚為必要，本文介紹的三七素檢測方法各有優缺點。用HP LC直接檢測三七素，雖然操作相對簡單，但如果樣品成分復雜，尤其是樣品中如含有大量的草酸等有機酸時，則對三七素的分析會造成嚴重干擾。就現有技術水平，分析三七素在人體或動物體內的動態變化，用定性和定量相結合的能定量和定性檢測的氣相色譜－質譜或液相色譜－質譜檢測法方法比較適宜。FIA法所用的儀器結構極為簡單，自動化程度高，如果用特異性高的固定化酶電極作為檢測手段則完全可以替代色譜－質譜聯用技術來快速準確地測定三七素含量。目前，人們還未分離到植物特異性三七素分解酶。從綿羊瘤胃中分離到了形態不同的 3種球菌，它們都可以分解利用三七素。如果能從中分離出分解三七素的酶，進一步開發出酶傳感器，則三七素的檢測會更加簡便。這種基于酶學的檢測方法或許是將來快速、準確檢測三七素的一種趨勢。

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S567.23+6

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1672-5018（2016）12-148-01