基于iTRAQ技術(shù)的肝細胞生長因子促進乳腺癌細胞侵襲的蛋白質(zhì)組學(xué)研究*

匡文斌，鄧秋嬋，舒少為，何樹泉，王強

（廣東省深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院 檢驗科，廣東 深圳 518110）

乳腺癌是臨床中較為常見的惡性腫瘤，近年來由于診斷技術(shù)的發(fā)展及生活方式的改變，該癥發(fā)病率呈上升趨勢，對女性健康及生活質(zhì)量具有嚴(yán)重影響。由于乳腺癌細胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移及侵襲的相關(guān)機制尚未完全清楚，因此對于乳腺癌的臨床診治難度較大。有研究指出，肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF）作為一種多功能細胞因子，在乳腺癌的生長、轉(zhuǎn)移以及侵襲中起著重要參與作用，乳腺癌細胞的侵襲同HGF表達具有密切關(guān)聯(lián)[1]。本研究為明確HGF對乳腺癌細胞侵襲的誘導(dǎo)作用，基于iTRAQ技術(shù)，對HGF促進乳腺癌細胞侵襲的蛋白質(zhì)組學(xué)進行探討，現(xiàn)報道如 下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取本院2012年3月-2014年3月收治的乳腺癌患者40例為研究對象，年齡28～56歲，平均（37.5±2.1）歲；TNM分期：15例為Ⅰ期；20例為Ⅱ期；5例為Ⅲ期。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)病理確診者；浸潤性導(dǎo)管癌；與本研究配合者。排除標(biāo)準(zhǔn)：心腦血管疾病者；精神神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；血液疾病者。

1.2 材料與試劑

iTRAQ Reagent Multi-Plex Kit和2D Quant Kit（Sigma公司)，胰蛋白酶（Gibco公司）肝細胞生長因子抗體（Santa Cruz公司）。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)提取消化 用層析柱Genway Seppro-TM（Genway Biotech,Inc.）去除高豐度蛋白質(zhì)，加入三氯乙酸TCA沉淀蛋白，蛋白定量后進行還原烷基化加入丙酮沉淀蛋白，復(fù)融后加入胰蛋白酶酶解。

1.3.2 iTRAQ標(biāo)記、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）分離肽段分為4組（iTRAQ-對照組，iTRAQ-Ⅰ期乳腺癌組，iTRAQ-Ⅱ期乳腺癌組，iTRAQ-Ⅲ期乳腺癌組），每組樣品對應(yīng)一個1個分子質(zhì)量。加入異丙醇混勻后再加入對應(yīng)樣品液中反應(yīng)2 h；標(biāo)記后各組肽段混合，加人緩沖液A，調(diào)整pH=3.0，用phenomenex SCX（200 a,4.6mm,250mm）過柱分離。

1.3.3 MS/MS鑒定 樣品用Ziptip層析柱脫鹽后，反相柱分離，ESI-QTOF-MS分析。用Data Analysis 4.0（Bruker）分析數(shù)據(jù)。經(jīng)MASCOT 2.2搜庫，Scaffold軟件分析，變化倍數(shù)2.0 倍以上為顯著差異。

1.3.4 Western Blot檢驗差異蛋白 提取蛋白，SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體抗體反應(yīng)，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯像和數(shù)據(jù)收集。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

血清中總共鑒定出264個蛋白，達到嚴(yán)格定量標(biāo)準(zhǔn)的蛋白有92個；乳腺癌與對照組間共篩選出19個差異表達蛋白；筆者選擇HGF作為其中表達差異較大的一個蛋白進行驗證。

iTRAQ標(biāo)記圖譜顯示乳腺癌組與健康對照組之間血清HGF表達水平具有較大差異，筆者通過Western Blot驗證結(jié)果證實，3組乳腺癌患者（3組分別為Ⅰ期乳腺癌患者；Ⅱ期乳腺癌患者；Ⅲ期乳腺癌患者）血清中HGF表達水平同健康對照組比較明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），這個與iTRAQ標(biāo)記圖譜鑒定結(jié)果一致，見圖1。

圖1 Western Blot驗證差異蛋白

3 討論

乳腺癌在所有女性惡性腫瘤中占有較高比例，多數(shù)患者在確診后已為中晚期，錯過最佳就治療時機，使得遠期存活率難以有效提高。對于乳腺癌發(fā)生侵襲以及轉(zhuǎn)移的機制進行研究，對于提高早期診斷率，改善治療效果，延長患者存活時間具有重要意義。HGF有34 kDa的β鏈和69 kDa的α鏈組成，最開始被認(rèn)為是一種能夠?qū)Τ墒旄渭毎a(chǎn)生分裂促進作用的細胞因子。但目前有研究表明，該物質(zhì)在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及侵襲中具有重要參與作用，且能夠促進腫瘤的血管形成，在較多惡性腫瘤中，如肝癌、肺癌以及乳腺癌等，均可發(fā)現(xiàn)HGF的特異性受體c-Met表達[2]。以HGF作為基因靶點進行腫瘤的治療及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制的研究是近年來的熱 點。

但目前關(guān)于HGF對于乳腺癌細胞侵襲促進作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機制尚未完全明確，需更為深入的研究，本研究通過iTRAQ技術(shù)對HGF促進乳腺癌細胞侵襲的具體調(diào)控作用進行了系統(tǒng)的研究，闡明了HGF過表達載體轉(zhuǎn)染MDA-MB-231乳腺癌細胞株前后蛋白表達的差異，建立HGF誘導(dǎo)MDAMB-231乳腺癌細胞侵襲的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。iTRAQ試劑的組成，是通過8種等量異位標(biāo)簽的分子完成，能夠同耐氨基酸側(cè)鏈以及氨基酸末端的胺標(biāo)記同重元素。iTRAQ多重化學(xué)標(biāo)記串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能夠鑒定所有種類的蛋白質(zhì)，具有強大功能，且該技術(shù)能夠?qū)Χ喾N樣品進行同時分析，具有高通量。研究發(fā)現(xiàn)，iTRAQ試劑可以標(biāo)記蛋白質(zhì)水解的肽段，并通過串聯(lián)質(zhì)譜方法，進行鑒別、定量[3]。且該技術(shù)的使用，可以得到的蛋白數(shù)量達到500～600種，并能獲得不同樣本間蛋白質(zhì)表達差異。

iTRAQ技術(shù)同其他同位素標(biāo)記技術(shù)比較，具有較多優(yōu)勢：①iTRAQ技術(shù)所標(biāo)記的同重元素量對不同樣本中的同一個蛋白質(zhì)是相同的，因此能夠比較不同樣品中的蛋白質(zhì)量；②iTRAQ能夠?qū)?～8個樣本進行同時標(biāo)記，且標(biāo)記效率高，過程簡單；③在樣本中加入iTRAQ試劑標(biāo)記的已知量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，可以對樣本中的蛋白進行絕對定量研究[4-5]。

綜上所述，iTRAQ技術(shù)能夠?qū)C體細胞、組織及體液的不同生理狀態(tài)進行研究，同時能夠?qū)Σ煌瑺顟B(tài)下的蛋白質(zhì)組異同進行有效分析。而對同正常生理狀態(tài)下的特異蛋白質(zhì)標(biāo)記物進行尋找與發(fā)現(xiàn)，能夠?qū)膊〉牟±頇C制進行充分了解，促進疾病的防控與診治。因此，基于iTRAQ技術(shù)的HGF促進乳腺癌細胞侵襲的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，能夠為乳腺癌的臨床診治進行有效指導(dǎo)，為靶向治療藥物的開發(fā)提供參考。

[1]曹美群,孫珂煥,吳安民,等.應(yīng)用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選乳腺癌患者血清差異表達蛋白[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2014,34(8):1054-1058.

[2]李莉,唐杰,于春霞,等.基于iTRAQ標(biāo)記結(jié)合2D nano HPLCESI-OrbiTrap MS/MS技術(shù)篩選卵巢癌血清標(biāo)記物[J].中國腫瘤臨床,2012,39(24):2075-2079.

[3]楊樺,張崇建,王子兵,等.浸潤性乳腺癌中肝細胞生長因子的表達及其與化療敏感性和預(yù)后的相關(guān)性[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,47(8):966-969.

[4]Zhen,C.Quan,W.Liang,L.et al.Comparative Evaluation of Two Isobaric Labeling Tags,DiART and iTRAQ[J].Analytical chemistry,2012,84(6):2908-2915.

[5]Feng,T.Yi,J.Wei,L.et al.Global Liver Proteome Analysis Using iTRAQ Labeling Quantitative Proteomic Technology to Reveal Biomarkers in Mice Exposed to Perfluorooctane Sulfonate (PFOS) [J].Environmental Science & Technology:ES&T,2012,46(21):12170-12177.