定量檢測HCMV pp67 m RNA快速診斷人巨細胞病毒活動性感染

鐘 峰，趙 俊，張業婷，姚 瑤，王明麗

定量檢測HCMV pp67 m RNA快速診斷人巨細胞病毒活動性感染

鐘 峰，趙 俊，張業婷，姚 瑤，王明麗

目的建立實時熒光定量逆轉錄PCR（Real time RT-qPCR）方法，檢測外周血中人巨細胞病毒（HCMV）pp67 mRNA的拷貝數，用于臨床快速診斷HCMV活動性感染。方法采用RT-qPCR測定86份癌癥患者外周血標本中的HCMV pp67 mRNA拷貝數，并與HCMV pp65抗原血癥檢測及HCMV分離培養的實驗結果進行比較。結果86例癌癥患者中，HCMV病毒分離檢測陽性率3.49%（3例）；實時熒光定量RT-PCR檢測陽性率17.44%（15例），靈敏度為100%，特異性為85.54%；HCMV pp65抗原血癥檢測陽性率為10.47%（9例），靈敏度為66.7%，特異度為92.8%。兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。通過受試者工作特征（ROC）曲線分析，RT-qPCR檢測每2×105個外周血白細胞中HCMV拷貝數的截斷點值為201.5；此病毒拷貝數可作為診斷HCMV活動性感染的參考閾值。結論應用RT-qPCR檢測HCMV活動性感染，靈敏度高、特異性好；并能夠為抗病毒治療供重要的參考依據。

人巨細胞病毒；pp67 mRNA；實時熒光定量RTPCR；活動性感染

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）屬皰疹病毒β亞科，為雙鏈DNA病毒。在人群中感染普遍，我國人群感染率高達90%以上［1］。HCMV在原發性感染后會潛伏于人體組織內并形成終身感染［2］。通常對免疫正常人無危害，但對免疫功能低下人群可造成致死性損傷［3-4］。研究［5］顯示，在腫瘤組織中檢測到HCMV核酸及抗原，表明HCMV感染可能與腫瘤發生發展相關。HCMV pp67是由UL65基因編碼的一種病毒結構性皮層蛋白，是HCMV復制晚期表達的基因產物。因此，pp67 mRNA的檢出能夠表明病毒呈活動性感染狀態［6］。臨床研究［7］表明，目前對HCMV早期活動性感染的診斷，遠不能達到臨床需求，存在盲目用藥或藥物毒性反應發生等不良反應。為了更好地預防和控制HCMV活動性感染，該研究以HCMVpp67 mRNA為靶基因，定量檢測HCMV基因拷貝數，目的是建立一個更適用于臨床需求的科學檢測方法，為臨床快速診斷與抗病毒治療用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株與病毒株人胚成纖維細胞株由安徽醫科大學微生物教研室自行制備，PCR鑒定排除皰疹病毒污染。HCMV AD169毒株由復旦大學醫學院微生物教研室提供，本實驗室保存。

1.2 病例資料收集2015年1月5日～2月13日安徽醫科大學第一附屬醫院老年科癌癥患者外周血標本86份，使用EDTA-K2抗凝管收集患者靜脈血3 ml，分別用于實時熒光定量PCR及pp65抗原血癥檢測和病毒分離。

1.3 實驗試劑與儀器DMEM培養基、小牛血清（美國Gibco公司）；mRNAiso Blood抽提試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉錄試劑盒、pMD18-TVector（日本Takara公司）；HCMV Brite Trubo Kit（荷蘭IQ公司）；DNA凝膠回收試劑盒和質粒小量提取試劑盒（杭州愛思進生物技術有限公司）；SYBR Green I Master、熒光定量PCR Lightcycler?480儀（瑞士Roche公司）。

1.4 PCR引物以GenBank中選擇病毒復制所必需的在各株間具有高度保守性的HCMV晚期基因（pp67基因）序列進行引物設計，由上海Invitrogen公司合成。pp67上游引物為5′-AAAAGAGACCGCGTCTCTGG-3′，下游引物為5′-TAGAGCCTGAGATGATGATG-3′，擴增產物為202 bp。以HCMV Town株的UL144基因為模板合成PCR引物，UL144上游引物為：5′-TCGTATTACAAAAAGCGGAGAGGAT-3′，下游引物為5′-ACTCAGACACGGTTCCGTAA-3′，擴增產物為736 bp。

1.5 病毒分離將第5～7代的HF細胞制成1× 105個/ml細胞懸液接種于細胞瓶，置5%CO237℃溫箱培養。抗凝血標本處理：將抗凝管采集的患者靜脈血3 ml靜置1 h后，于4℃2 000 r/min離心10 min，取離心后得到的白細胞0.2 ml接種至已長成單層的HF細胞，37℃孵育1 h，更換維持液，置5%CO2孵育箱37℃培養。接種標本的細胞每周傳代1次，每天通過倒置顯微鏡觀察細胞有無CPE。

1.6 HCMVpp65抗原血癥應用荷蘭IQ公司生產的HCMV Brite Turbo Kit（L14041）檢測血標本中白細胞HCMV pp65抗原。試劑盒檢測步驟：使用裂解液去除紅細胞，1 000 r/min離心10 min收集白細胞；調整細胞數為2×105/ml，制備涂片；固定破膜；加入一抗，孵育60 min；加入二抗，孵育30 min；封片，熒光顯微鏡下讀片，判讀結果。

1.7 熒光定量RT-PCR方法建立

1.7.1標準品的構建 采用mRNAiso Blood抽提試劑盒，從感染HCMV AD169株的細胞內提取總RNA，RT-PCR擴增并制備pp67基因的目的片段，擴增產物經過回收純化后與pMD18-T載體連接成重組質粒，轉化到大腸桿菌DH5α中，挑取陽性克隆，用AxyPrep小提質粒試劑盒提質粒，用PCR對重組質粒進行鑒定。根據重組質粒的光密度（optical density，OD）值換算出重組質粒的拷貝數，梯度稀釋后作為標準品。

1.7.2熒光定量RT-PCR反應條件 實時熒光定量PCR反應條件（循環參數）：95℃5 min；95℃10 s，60℃20 s 72℃20 s（40循環）40℃10 s。20μl總體積最適反應體系為：引物0.5μmol 1μl、SYBER Green IMaster 10μl、H2O 6μl、DNA模板2.0μl。

1.7.3靈敏度及穩定性試驗 以制備的標準品為模板，進行10倍系列梯度稀釋，取8個稀釋度的mRNA按反應條件和體系進行熒光定量RT-PCR，以不同模板濃度的擴增曲線所在的Ct值確定此方法的靈敏度。并以批內每個稀釋度的2個復孔進行平行試驗。

1.7.4特異性試驗 分別對與HCMV同種屬的其它皰疹病毒如HSV1、HSV2和VZV進行RNA抽提并作為模板，并設立正常細胞對照及空白對照，在相同的反應體系和擴增參數條件下進行實時熒光定量RT-PCR。鑒定該方法的特異性。

1.7.5標準曲線的制備 將標準品從4.08×107拷貝數/μl依次10倍系列稀釋，共計7個濃度梯度。每個稀釋度進行2次重復，以平均Ct值為橫坐標，模板濃度的對數為縱坐標自動生成標準曲線。

1.8 結果判定病毒分離結果著重在鏡下觀察接種標本后的HF細胞單層上在4周內有無出現HCMV特征性CPE；對CPE陽性者，取樣進行PCR，檢測HCMV UL144基因。陽性的PCR產物經測序比對后，方可確認為病毒分離陽性；HCMV pp65抗原血癥檢測陽性結果的認定為，在熒光顯微鏡下觀察到HCMV pp65陽性細胞的細胞核呈均勻的蘋果綠熒光，以2×105個多形核白細胞中pp65抗原陽性細胞≥1個為陽性；全血HCMV實時熒光定量PCR檢測結果以全血HCMV mRNA拷貝數≥最低檢測限為陽性。

1.9 統計學處理采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計數資料進行χ2檢測。ROC曲線及最佳截斷點評估熒光定量RT-PCR診斷的價值，以曲線下面積表示。

2 結果

2.1 病毒分離CPE觀察及分離株鑒定

2.1.1細胞CPE觀察 鏡下觀察在86份接種了臨床標本的細胞單層上，發現病毒分離陽性的細胞明顯變圓、腫脹、折光性增強、形態及排列不規則、細胞內顆粒增多，呈典型的巨細胞病毒特征性CPE現象。見圖1。

2.1.2分離株鑒定 本次實驗成功分離出3例HCMV臨床病毒株。PCR檢測陽性產物由通用生物系統（安徽）有限公司對分離的病毒株進行UL144基因鑒定，測序結果經過BLAST比對顯示，被測基因片段序列與GenBank報道Town株序列匹配達98%，確認為HCMV臨床病毒分離株。見圖2。

2.2 HCMVpp65抗原血癥檢測86份樣本中，檢測HCMV pp65抗原血癥陽性患者9例（陽性率10.47%），熒光顯微鏡下觀察HCMV pp65陽性細胞核呈現出均勻綠色熒光（圖3B），陽性細胞數≥1/2 ×105外周血白細胞判為陽性，陽性標準品對照由試劑盒提供（圖3A）。紅色熒光為伊文斯蘭襯染細胞激發出的紅光。

2.3 HCMVpp67mRNA熒光定量RT-PCR方法的建立本次實驗成功建立了HCMV pp67 mRNA熒光定量RT-PCR方法，構建了HCMV的陽性標準品，制作了標準曲線，擴增效率達到1.786，反應靈敏度達到4.08×10 copies/μl，對于已構建的陽性樣本為特異性擴增，而陰性對照物無特異性擴增，組內與組間重復性良好。

2.3.1靈敏度及穩定性試驗 實時熒光定量RTPCR檢測HCMV pp67 mRNA擴增曲線，呈典型的S形上升曲線，模板在每兩個相鄰的稀釋度之間的Ct值相差約3個單位，實驗檢測模板最低含量限度為40.8拷貝數/μl。每個稀釋度重復的平行對照Ct值基本一致，表明實驗體系的穩定性良好，見圖4。

2.3.2特異性試驗 檢測所構建方法的特異性，對HCMV、HSV1、HSV2、VZV、正常細胞對照的DNA模板進行熒光定量RT-PCR，非靶目的DNA對照組無熒光曲線的增長，只有HCMV病毒對照組出現陽性擴增曲線，此結果顯示該方法有良好的特異性見圖5。

2.3.3標準曲線的制備 分別用10倍系列稀釋的標準品作為模板，以模板拷貝數的對數作為橫坐標。以平均Ct值為縱坐標，生成出一條直線型的標準曲線：方程為Y=-3.97log（X）+42.65，斜率為-3.970，擴增效率為1.786，見圖6。

2.4 HCMVpp67mRNA熒光定量PCR與pp65抗原血癥檢測結果比較對86份患者全血進行檢測，HCMV pp67 mRNA熒光定量PCR陽性為15例，陽性率17.44%。HCMV pp65抗原血癥檢測陽性9例，陽性率10.47%。這兩種方法所得結果符合率為90.70%。兩種檢測方法結果之間進行統計學處理，應用校正χ2檢驗公式，即HCMV pp67mRNA熒光定量PCR檢測陽性率與pp65抗原血癥檢測陽性率相比，差異有統計學意義（χ2=30.308，P＜0.01）。

2.5 HCMVpp67mRNA熒光定量RT-PCR檢測結果與病毒分離的比較病毒分離陽性樣本（3例）中RT-qPCR檢測全為陽性，RT-qPCR檢測陰性樣本（71例）中病毒分離未見陽性。RT-qPCR檢測方法靈敏度為100%，特異性為85.54%，陽性預測值（PPV）0.20，陰性預測值（NPV）1.00，差異有統計學意義（χ2=9.372，P＜0.05）。

2.6 HCMV熒光定量RT-PCR最佳診斷閾值的確定以靈敏度為縱坐標，誤診率（1-特異度）為橫坐標，在SPSS17.0軟件上作ROC曲線并計算曲線下面積。HCMV熒光定量RT-PCR檢測方法的ROC曲線下面積為0.823，準確性較好。以Youden指數接近1時對應的數值為cutoff值，得到cutoff值為201.5拷貝數/2×105PBLs，提示此方法檢測的cutoff值可作為臨床診斷HCMV活動性感染的指標。見圖7。

3 討論

HCMV基因復制具有時序性，分為立即早期（IE）、早期（E）和晚期（L）基因，活動性感染的重要標志就是晚期基因的出現。目前pp65抗原血癥檢測被廣泛認為是HCMV活動性感染的“金標準”［8］。但是這種方法也存在一些缺點：實驗工作量多，耗時長，觀察結果需要專業熟練的技術人員，技術不能夠標準化，精確的臨床確診參考閾值仍然沒有確定。HCMV pp67 mRNA是病毒復制晚期表達的基因，文獻［9］報道pp67 mRNA檢測與IE基因比較，前者能夠更好地反映HCMV在體內活動性感染。

本研究對86份癌癥患者外周血白細胞樣本進行檢測。以熒光定量RT-PCR和HCMV pp65抗原血癥檢測結果相比較，二者符合率為90.70%。通過ROC曲線分析，熒光定量RT-PCR檢測的cutoff值為201.5拷貝數/2×105PBLs，對應靈敏度為73.33%，特異度為72.26%。但是由于標本數量過少及檢測方法有待進一步優化，實驗數據有待進一步提高。

惡性腫瘤現已成為我國人口死亡的主要原因之一，現主要治療手段有手術、化療和放療，而在殺死癌細胞的同時也會殺死大量正常細胞，導致腫瘤患者免疫功能大大降低，并由此誘導HCMV再激活而導致活動性感染。與此同時，HCMV活動性感染對腫瘤細胞周期的影響、參與腫瘤細胞的凋亡及調節腫瘤細胞的免疫逃逸，對腫瘤的發展起到重要的作用，并能夠增加腫瘤的惡性程度［10-11］，目前研究［12-14］表明，HCMV感染與腫瘤細胞數量及惡性程度有關。將抑制HCMV復制及調節病毒基因編碼的mRNA表達作為腫瘤治療的一個新靶目標，能夠拓展腫瘤治療的一個新領域，為臨床治療腫瘤提供新的思路，同時也能預防并減少因HCMV活動性感染造成器官損傷，包括肺炎、腸炎、視網膜炎等終末器官綜合征。

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The quantitative detection of human cytomegalovirus pp67 mRNA in rapid diagnosis of active human cytomegalovirus infection

Zhong Feng，Zhao Jun，Zhang Yeting，et al
（Dept of Microbiololgy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo explore the detection of HCMV pp67mRNA in peripheral blood by RT-PCR for the diagnosis of HCMV active infection.MethodsThe peripheral blood samples of 86 postoperative cancer patients were measured by the real-time quantitative PCR（RT-PCR）.The resultswere compared with pp65 antigenemia test and HCMV virus isolation.ResultsIn the 86 cancer patients，15 patientswere positive in pp67mRNA RT-PCR，9 patientswere positive in pp65 antigenemia test，3 patients were positive in virus isolation.The sensitivity of HCMV pp67 mRNA RT-PCR was 100%，and the specificity was 87.9%，the sensitivity of HCMV pp65 antigenemia was 66.7%and the specificity was 92.8%，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The result of ROC curve analysis showed the cutoff value of real-time RT-qPCR is 201.5copies/2×105Peripheral blood leucocyte cells，these hint this virus content can be used as a reference threshold of HCMV active infection.ConclusionThe sensitivity and specificity of the RT-qPCR are good，which can provide fast and accurate diagnosis of HCMV active infection，and lay the basis for clinical antiviral treatment.

human cytomegalovirus；pp67 mRNA；Real time RT-PCR；active infection

R 373.9

A

1000-1492（2016）03-0324-05

時間：2016/1/28 14：23：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.006.html

2015-12-25接收

國家自然科學基金（編號：30872253）；安徽省教育廳自然科學重大研究項目（編號：KJ2012ZD08）

安徽醫科大學微生物學教研室，合肥 230032

鐘 峰，男，碩士研究生；

王明麗，女，教授，碩士導師，責任作者，E-mail：1952987441 @qq.com