酸性微環境促進前列腺癌細胞PC-3遷移并活化Rac1蛋白

高 漓，譚 寧，張天禹，何小龍，郭維杰，張振鋒，查若朋

酸性微環境促進前列腺癌細胞PC-3遷移并活化Rac1蛋白

高 漓1，譚 寧2，張天禹1，何小龍1，郭維杰3，張振鋒3，查若朋3

目的探討腫瘤外周酸性微環境對PC-3前列腺癌細胞遷移的影響，并探討其可能的作用機制。方法將PC-3前列腺癌細胞分別培養在不同pH（7.4、7.0、6.6）的細胞培養基中，通過體外實驗，分析PC-3細胞在侵襲、遷移等轉移能力上的改變；對細胞骨架肌動蛋白Actin進行染色，通過激光共聚焦顯微鏡觀測腫瘤外周酸性微環境對細胞骨架肌動蛋白聚合的影響；通過Western blot實驗，檢測腫瘤外周酸性微環境對PC-3前列腺癌細胞Rac1蛋白活化的影響。結果當腫瘤外周微環境向酸性變化時，PC-3細胞的侵襲及遷移能力均顯著增強（P＜0.01）；激光共聚焦顯微鏡觀測結果提示，腫瘤外周酸性微環境促進細胞骨架肌動蛋白的聚合；Western blot檢測結果顯示，腫瘤外周酸性微環境促進PC-3細胞Rac1蛋白的活化。結論腫瘤外周酸性微環境對PC-3細胞遷移的促進作用與Rac1蛋白活化密切相關。

酸性微環境；前列腺癌；遷移；肌動蛋白；Rac1

前列腺癌是威脅男性健康的常見腫瘤之一，2008年調查數據顯示，其發病率和死亡率分別位居全球男性全部惡性腫瘤的第2位（14%）和第6位（6%）［1］。雖然與發達國家相比，中國仍是前列腺癌的低發國家，但近年來隨著中國人口老齡化步伐的加快、前列腺癌診療水平的提高和生活方式的轉變等多種原因，中國前列腺癌發病和死亡均呈明顯上升態勢［2］。前列腺癌轉移是前列腺癌患者死亡的主要原因，對于已經轉移的前列腺癌，往往難以通過手術及放療等治療來獲得理想的治療效果。前列腺癌的轉移與否，對前列腺癌治療效果及預后有決定性的影響。研究［3］顯示，腫瘤的轉移是一個相互關聯的多步驟的過程，包括原發癌的擴展、腫瘤血管生成、腫瘤細胞脫落并在黏附基質后侵襲、腫瘤細胞進入脈管系統遷移、轉移癌栓的形成、在繼發組織器官定位生長、以及轉移癌繼續擴散等。腫瘤的轉移不僅取決于腫瘤細胞自身的特性，如腫瘤轉移相關基因的活化及失活；還涉及到腫瘤細胞與腫瘤微環境間的相互作用，如腫瘤細胞與巨噬細胞［3］，腫瘤細胞與腫瘤基質中的血管內皮細胞、纖維母細胞［4］，腫瘤細胞與腫瘤酸性微環境等［5］。該研究通過將前列腺癌細胞PC-3培養于不同pH（7.4、7.0、6.6）的細胞培養基中，以觀察細胞外周酸性微環境對PC-3細胞轉移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料前列腺癌PC-3細胞株購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清購自美國Gemini公司（Cat No.900-208）；DMEM購自美國Gibco公司（Cat No.12430-047）；Alexa FluorR 594 phalloidin購自美國lifetechnologies公司（Cat No.A12381）；Rac1活性檢測試劑盒（Cat No.17-441）購自美國Millipore公司；β-actin（Cat No.sc-47778）購自美國Santa Cruz公司；ECL發光底物試劑盒購自美國Pierce公司；Transwell小室（內徑為6.5mm，孔徑為8.0μm）及MatrigelTM均購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養基配制 使用HCl或NaOH將DMEM（Cat No.12430-047）調至pH 7.4、7.0及6.6，過濾后加入胎牛血清（10%）備用。

1.2.2細胞體外侵襲實驗 將Transwell小室放入24孔細胞培養板，在每個上室的聚碳酸酯膜上涂以50μg Matrigel膠（用無血清DMEM稀釋）；下室加入含10%FBS的DMEM培養基800μl。取對數生長期細胞，用胰酶消化，離心（1 000 r/m，5 min）后重懸于無血清DMEM培養液，上室內加入2×105個細胞/室，繼續使用pH 7.4、7.0及6.6培養基培養48 h后，吸棄小室內培養基，取出小室。用棉簽拭去膜基質和上室內表面細胞，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，在光學顯微鏡下拍照并計數［6］。每組設3個平行樣本，每個樣本觀測5個視野（10×）并進行全孔計數。實驗重復3次。

1.2.3細胞體外遷移實驗 細胞體外遷移實驗與侵襲實驗方法相同，但Transwell小室底部膜的內表面上未鋪Matrigel。取對數生長期細胞，用胰酶消化，離心（1 000 r/m，5 min）后重懸于無血清DMEM培養液，上室內加入2×105個細胞/室，使用pH 7.4、7.0及6.6培養基培養48 h，吸棄小室內培養基，取出小室。用棉簽拭去膜基質和上室內表面細胞，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，洗去染色液，空氣干燥，在光學顯微鏡下拍照。然后加入10%的冰醋酸，靜置30 min，待結晶紫溶解后，各實驗組分別取100μl于96孔板中，使用光柵型連續波長酶標儀（infinite M200 PRO儀器），讀取各孔在560 nm波長處吸光值并記錄。每組設3個平行樣本，實驗重復3次。

1.2.4細胞骨架肌動蛋白Actin染色 PC-3細胞分別使用pH7.4及pH6.6培養48 h后，用PBS液漂洗蓋片培養的細胞3次，之后用4%的甲醛/PBS液固定細胞10 min，PBS漂洗3次；用Alexa FluorR 594 phalloidin在（1∶10）室溫中反應15 min后，PBS漂洗3次，使用60%甘油+熒光防淬劑封片。使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，激發波長581 nm，發射波長609 nm。

1.2.5Rac1活化蛋白檢測 PC-3細胞分別使用pH7.4及pH6.6培養48、72 h后，按試劑盒說明書進行操作，提取細胞蛋白，進行Western blot實驗。將提取的蛋白，經丙烯酰胺凝膠（12%分離膠+6%濃縮膠）電泳后轉移至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，Rac1一抗（1∶500稀釋，鼠源性）、β-actin一抗（1∶500稀釋，鼠源性）4℃孵育過夜，TBST洗滌，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（1∶1 000稀釋）孵育2 h，TBST洗滌，與免疫印跡化學發光試劑（ECL）反應，X線片曝光，顯影，定影。

1.3 統計學處理采用SPSS 13.0軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析，取95%可信區間，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 酸性微環境促進前列腺癌細胞PC-3的侵襲

在侵襲實驗中，pH 7.4、7.0及6.6組均設3個平行樣本，實驗重復3次，在不同pH培養基培養48 h后終止實驗。結果統計顯示，pH 7.4、7.0及6.6組發生侵襲的細胞個數分別為（134.3±17.55）、（273.7±14.61）、（418.67±14.43），pH6.6組發生侵襲的細胞個數明顯高于pH7.4組及pH7.0組差異有統計學意義（F=124.79，P＜0.01）。見圖1。

2.2 酸性微環境促進前列腺癌細胞PC-3的遷移

在遷移實驗中，pH 7.4、7.0及6.6組均設3個平行樣本，實驗重復3次。在不同pH培養基培養48 h后終止實驗并進行結晶紫染色，然后加入10%的冰醋酸2 ml；待結晶紫溶解后，取100μl于96孔板中，使用酶標儀（infinite M200 PRO儀器）記錄各孔在560 nm波長處吸光值。pH 7.4、7.0及6.6組所測OD值分別為（0.045 1±0.005 8）、（0.066 1± 0.007 9）、（0.136 0±0.008 9），差異有統計學意義（F=53.501，P＜0.01）。見圖2。

2.3 酸性微環境促進前列腺癌細胞PC-3細胞骨架肌動蛋白的聚合將前列腺癌細胞PC-3進行細胞爬片，在不同pH培養基培養48 h后終止實驗，4%多聚甲醛（D-PBS溶液配制）固定細胞15 min，使用Alexa FluorR 594 phalloidin對細胞骨架肌動蛋白進行染色，通過激光共聚焦顯微鏡進行觀測。觀測結果顯示，與pH7.4組細胞相比，pH6.6組的PC-3細胞內的F-actin呈現明亮的紅色，呈細束狀竹排樣結構，沿細胞極性平行排列。與pH7.4組細胞相比，pH6.6組PC-3細胞內的F-actin聚合更明顯。見圖3。

2.4 酸性微環境促進前列腺癌細胞PC-3Rac1蛋白的活化在不同pH培養基培養前列腺癌PC-3細胞，于48 h后提取細胞蛋白，進行Rac1活化蛋白及Rac1 Western blot檢測。實驗結果顯示，pH6.6組細胞Rac1活化形式GTP-Rac1明顯高于pH7.4組細胞（圖4A）。Rac1活化形式GTP-Rac1光密度值與Rac1光密度值比值為：pH7.4組：0.134 3± 0.008 7（經GAPDH校正）（n=3），pH7.0組：0.777 7±0.040 4（經GAPDH校正）（n=3），pH6.6組：1.173 3±0.028 5（經GAPDH校正）（n=3）（F= 506.60，P＜0.01）（圖4B）。

3 討論

腫瘤的轉移分多個步驟進行，包括腫瘤細胞在原位癌的脫離與遷移、侵襲并降解細胞外基質、侵入血液血管和循環系統、在一個遙遠的部位再生長等諸多步驟。這一過程不僅與腫瘤的遺傳背景密切相關，更受到腫瘤所在微環境的強烈影響。腫瘤血管結構和功能的改變是腫瘤微環境的生成關鍵因素，腫瘤血管結構和網絡功能的畸變導致腫瘤局部氧氣和營養的供應不足，從而導致腫瘤代謝的變化，腫瘤細胞代謝重組，其能量代謝向糖酵解轉變［7］。腫瘤細胞糖酵解的發生，以及腫瘤血管結構和網絡功能畸變所導致的低灌注，使腫瘤細胞外周乳酸升高，從而使腫瘤外周呈明顯的酸化［8］。酸性腫瘤微環境不僅促進血管生成［9］，抑制抗腫瘤免疫反應［10］，更影響腫瘤侵襲和轉移［11］。本研究的侵襲及遷移實驗中，使用不同pH培養基培養前列腺癌細胞PC-3，發現酸性微環境可以明顯促進前列腺癌細胞PC-3的侵襲與遷移。

研究［12］表明，pH值可以刺激細胞的運動遷移，并導致細胞骨架的重組。本研究使用不同pH培養基培養前列腺癌細胞PC-3，采用Alexa FluorR 594 phalloidin對細胞骨架肌動蛋白（Actin）進行染色，通過激光共聚焦顯微鏡進行觀測。觀測結果顯示，與pH7.4組細胞相比，pH6.6組的PC-3細胞內的F-actin呈現明亮的紅色，呈細束狀竹排樣結構，沿細胞極性平行排列。證實酸性微環境可以促進前列腺癌細胞PC-3細胞骨架肌動蛋白（Actin）的聚合。

細胞運動過程不但涉及細胞不同部位的肌動蛋白骨架的連續重構，還包括遷移細胞與細胞外基質間的黏附和解黏附過程，該過程包括如下幾個步驟：細胞在運動方向上形成片狀偽足及絲狀偽足、在偽足面上細胞表面蛋白酶（例如基質金屬蛋白酶）選擇性降解細胞外基質、細胞遷移前緣與細胞外基質形成新的黏附點而后緣的黏附結構解離［13］，細胞運動過程主要由Rho蛋白家族的一組Ras相關蛋白進行調控［14］。

目前為止，在人類細胞中已經發現了20多個Rho蛋白家族成員，分為3個亞家族—Rho蛋白、Rac蛋白和Cdc42蛋白。該蛋白家族成員結合GTP時處于活化狀態，當GTP水解成GDP時處于失活狀態［15］。Rho蛋白家族在調節肌動蛋白（細胞骨架）的活動、細胞分裂增殖、細胞變形中起關鍵作用，從而調控細胞遷移、參與腫瘤的轉移。其中亞家族Rac1全稱為Ras相關的C3肉毒素底物1，有調節細胞骨架重組，片狀偽足形成，細胞形體極化，促進細胞運動與遷移，促進血管生成的作用。Rac1對細胞侵襲和遷移的可能機制為：①促進整合素家族蛋白在細胞頭部募集，并將細胞級聯信號傳遞到細胞肌動蛋白骨架，誘導肌動蛋白微絲聚集，產生片狀偽足；②活化下游重要調節因子凝溶膠蛋白，改變肌動蛋白細胞骨架，影響細胞的運動及侵襲力；③通過與下游的血小板源性生長因子的信號途徑、百日咳毒素敏感性G蛋白及cAMP依賴性途徑相互作用影響細胞的運動［16］。本研究使用不同pH培養基培養前列腺癌細胞PC-3，提取細胞蛋白，進行Western blot檢測，發現酸性微環境明顯促進前列腺癌細胞PC-3 Rac1蛋白的活化。

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Acidic extracellular m icroenvironment promotes PC-3 cell m igration and enhances the activity of Rac1

Gao Li1，Tan Ning2，Zhang Tianyu1，et al
（1Dept of Urology，The Affiliated Hospital，Guilin Medical College，Guilin 541004；2The Center of Science Research，Guilin Medical College，Guilin 541004）

ObjectiveTo investigate whether tumor acidic-microenvironment can promote the migration of human prostatic carcinoma cell PC-3.MethodsPC-3 cellswere cultured inmediawith different pH values（pH 7.4，pH 7.0，pH 6.6）.Invasion and migration assay were utilized to analyze themetastasis of PC-3 cells in vitro.F-actin fluorescence staining was performed and observed by 1aser confocal scanning microscope.The activation of Rac1 was examined by western blot.ResultsAcidic microenvironment could enhance the capacity of PC-3 cellmigration and invasion remarkably（P＜0.01）.Meantime，the intensity of F-actin significantly was increased and the activity of Rac1was up-regulated.ConclusionThe results suggest that acidic microenvironmentmay be involved in cancermetastasis and play an important role in promotion of cancermetastasis.

acidic extracellularmicroenvironment；human prostatic cancer；migration；actin；Rac1

R 737.25

A

1000-1492（2016）03-0333-05

時間：2016/1/28 14：23：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.010.html

2015-12-08接收

廣西自然科學基金項目（編號：2010GXNSFA183013）；桂林市科學研究與術開發計劃項目（編號：20130120-15）

1桂林醫學院附屬醫院泌尿外科、2桂林醫學院科學實驗中心，桂林 541004

3上海市腫瘤研究所癌基因及相關基因國家重點實驗室，上海 200032

高 漓，男，副主任醫師；

譚 寧，男，副研究員，碩士生導師，責任作者，E-mail：wind146wind@aliyun.com