成骨細胞特異性識別多肽對人成骨細胞增殖和礦化影響的實驗研究

錢海燕，陳慧敏，杜明亮，吳明月，李全利

成骨細胞特異性識別多肽
對人成骨細胞增殖和礦化影響的實驗研究

錢海燕，陳慧敏，杜明亮，吳明月，李全利

目的觀察成骨細胞特異性識別多肽對人顱骨成骨細胞（HCO）增殖和礦化作用的影響。方法體外常規培養人顱骨成骨細胞，分為5個實驗組（10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L）以及空白對照組，MTT法檢測細胞的增殖，紫外分光光度法檢測細胞堿性磷酸酶（ALP）的表達，茜素紅染色及半定量分析檢測細胞礦化程度，RT-QPCR法檢測細胞骨鈣素（OCN）mRNA的表達。結果此濃度范圍內的特異性多肽對成骨細胞增殖有促進作用（P＜0.05），最大效應濃度是10-5mol/L；能增加ALP活性（P＜0.05），最大效應濃度是10-4mol/L。通過茜素紅染色觀察和半定量分析，14、21 d實驗組鈣鹽沉積量高于對照組，半定量分析結果顯示濃度10-5mol/L時，吸光度（OD）值最高，但差異無統計學意義；RT-QPCR法顯示14、21 d實驗組OCN mRNA表達量均高于對照組（P＜0.05）。結論10-8～10-4mol/L濃度范圍的成骨細胞特異性識別多肽能夠促進人顱骨成骨細胞的增殖和礦化，且在10-5mol/L濃度促進成骨細胞增殖及礦化相關蛋白表達最為顯著。

成骨細胞特異性識別多肽；人顱骨成骨細胞；增殖；礦化

成骨細胞是骨組織中的重要細胞，骨愈合過程中的新骨形成主要是由成骨細胞參與完成。臨床上牙拔除后牙槽骨的愈合以及牙種植體植入頜骨后骨結合的形成，皆需要進行以成骨為主的組織修復，因此，成骨細胞成為骨組織修復研究領域中最為關注的細胞之一。而通過體外實驗研究諸如生長因子等相關生物活性分子對成骨細胞增殖礦化的調控，對于了解其在骨形成中的作用及其應用具有重要意義［1］。該研究采用的成骨細胞特異性識別多肽，是課題組前期的研究成果，即以人的顱骨成骨細胞為陽性靶細胞，對噬菌體展示十二肽庫進行全細胞差減篩選，獲得與人成骨細胞特異性結合多肽，其氨基酸序列為：VLAVPWSEPGYL。該研究的目的旨在探討成骨細胞特異性識別多肽對人成骨細胞增殖和礦化功能的影響，摸索出成骨細胞特異性識別多肽體外促進人成骨細胞增殖礦化的最佳有效濃度，為該特異性多肽的進一步研究及應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器α-MEM培養基、胎牛血清（美國HyClone公司）；成骨細胞特異性識別多肽（上海科肽生物科技有限公司）；胰蛋白酶（美國Gibco公司）；堿性磷酸酶試劑盒（中國碧云天生物技術有限公司）；MTT試劑盒（中國索萊寶生物科技有限公司）；茜素紅染液、氯化十六烷基吡啶（美國Sigma公司）；SYBR Premix Ex TaqII染料法熒光定量試劑盒、One Step RNA PCR Kit試劑盒（日本TaKaRa公司）；塑料培養瓶培養板（美國Corning公司）；CO2孵箱（美國Thermo公司）；雙人雙面超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；酶標儀（美國Bio-tek公司）；熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司）；熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；移液器（德國Eppendolf公司）等。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人顱骨成骨細胞株購于上海撫生實驗有限公司，10%FBS的α-MEM培養基常規培養，細胞融合約80%～90%時，1∶2比例傳代，每3 d換液一次。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖 實驗組：特異性多肽用10%FBS的α-MEM培養基配成5個濃度組，即10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。對照組：10%FBS的α-MEM培養基培養。細胞消化后，8× 104個/ml的細胞密度接種于96孔板中，24 h后實驗組更換含多肽培養液繼續培養，于4、7 d取出96孔板，進行MTT檢測，酶標儀490 nm波長下測各孔吸光度（optical density，OD）值。

1.2.3堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測 分組同上。細胞消化后，8×104個/ml的細胞密度接種于6孔板中，24 h后實驗組更換含多肽培養液繼續培養，于4、7 d取出6孔板，按照ALP檢測試劑盒步驟檢測。將ALP活性除以細胞總蛋白即可得到單位蛋白含量的相對ALP活性。

1.2.4茜素紅染色及半定量分析檢測細胞鈣化程度 分組同上。細胞消化后，8×104個/ml的細胞密度接種于24孔板中，24 h后實驗組更換含多肽培養液繼續培養，于14、21 d取出24孔板，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，1%茜素紅染色，掃描儀掃描照片。每孔加入氯化十六烷基吡啶，室溫下放置30 min。待茜素紅溶解后，酶標儀562 nm波長下測OD值。

1.2.5RT-QPCR檢測細胞OCN mRNA的表達分組同上。細胞消化后，8×104個/ml的細胞密度接種于6孔板中，24 h后實驗組更換含多肽培養液繼續培養，于14、21 d取出6孔板，按照TRIzol RNA提取試劑盒提取每組樣本RNA，One Step RNA PCR Kit說明書進行逆轉錄。RT-QPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成并經質量檢測，β-actin上游序列及下游序列分別是5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′和5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′；OCN上游序列及下游序列分別是5′-ATGAGAGCCCTCACACTCCT-3′和5′-CTTGGACACAAAGGCTGCAC-3′。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ染料法熒光定量試劑盒進行RT-QPCR檢測，配成20μl反應體系：SYBR Premix Ex TaqII 10μl、ROX DYEⅡ0.4μl、上下游引物各0.8μl，cDNA 2μl、ddH2O 6μl。

1.3 統計學處理采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，實驗數據用-x±s表示。組間比較采用單因素方差分析，進一步分析采用LSD法進行多重比較。

2 結果

2.1 MTT法檢測成骨細胞增值第4、7天，實驗組OD值均高于對照組，差異均有統計學意義（F= 3.368、60.778，P＜0.05），且第7天實驗組濃度為10-5mol/L時，OD值最高，并與其他實驗組差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 ALP相對活性檢測結果第4天，實驗組與對照組比較，差異無統計學意義（F=2.704）。第7天，實驗組與對照組比較，差異有統計學意義（F= 32.449，P＜0.05），且實驗組濃度為10-4mol/L時，ALP相對活性最高，并與其他實驗組差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 茜素紅染色及半定量分析第14、21天，實驗組鈣鹽沉積量多于對照組，見圖1、2。半定量分析結果，實驗組濃度為10-5mol/L時，OD值最高，但可能由于樣本量過小，差異無統計學意義（F= 1.499、2.044），見表2。

2.4 RT-QPCR法檢測骨鈣素（osteocalcin，OCN）mRNA的表達水平第14、21天，實驗組成骨細胞骨鈣素mRNA的表達量約是對照組的5～13和10～35倍，差異有統計學意義（F=10.72、94.871，P＜0.05）。21 d實驗組濃度為10-6mol/L時，與其他實驗組差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

成骨細胞是參與骨生成、生長、吸收、代謝的關鍵細胞，骨組織的形成主要是由成骨細胞分泌類骨質，類骨質再進一步成熟并繼發礦化形成新骨，在整個過程中經歷細胞增殖、胞外基質成熟、礦化和細胞凋亡四個階段［2-3］。骨的代謝過程受到體內許多因素的調節，如鈣、磷、鎂、內分泌激素和維生素等，其中，存在于骨基質中的各種生長因子在骨形成、吸收和重建中發揮著至關重要的作用，歷來備受廣大學者關注。目前，國內外學者對各種骨代謝相關生長因子對成骨細胞和骨髓基質細胞增殖、分化的影響做了大量的研究，也取得了一定的進展，但是這些生長因子在免疫原性、修飾易變性、體內易酶解等方面存在著各自的不足［4-5］。因此，獲得一種生物學性能更加優越的生物活性分子，成為當前研究熱點。而成骨細胞的早期趨化、增殖的性能，對于臨床上骨缺損后的骨愈合以及牙種植的骨結合均具有特別重要的意義［6］。本研究采用的成骨細胞特異性識別多肽，是基于噬菌體展示技術，對噬菌體展示十二肽庫進行全細胞差減篩選，獲得的與人成骨細胞特異性結合的弱親水性多肽結構，氨基酸序列為VLAVPWSEPGYL，其結構簡單、易消毒儲存、較蛋白質更易設計和修飾、具有良好的生物相容性［7-9］。

成骨細胞表型是逐步形成的，各種成骨標志物在細胞增殖礦化的各個時期有不同程度的表達［2-3］。本研究通過體外細胞學實驗來檢測該特異性多肽在促進成骨方面的生物學性能，分別從細胞增殖實驗、成骨細胞增殖早期ALP的表達、細胞茜素紅染色以及OCN的mRNA的表達幾方面進行研究，結果顯示：10-8～10-4mol/L濃度范圍的特異性多肽能夠顯著促進成骨細胞增殖和礦化。其中，10-5mol/L濃度的多肽對成骨細胞增殖及礦化的促進作用最為顯著。由上可知，一定濃度的特異性識別多肽在成骨細胞生長各階段對其骨形成的生物學功能皆具有促進作用。

臨床上，任何形式骨缺損后的骨愈合以及牙種植體植入頜骨后骨整合的形成，皆需要進行以成骨為主的組織修復，而新骨的形成主要是由成骨細胞完成，因此，促進成骨細胞的增殖、礦化能力，一直是該領域研究的中心問題。研究［6］表明，種植體周骨細胞向種植體表面遷移、募集、吸附的效率會直接影響骨結合的發生、發展及最終效果。本研究證實，課題組設計篩選并合成的成骨細胞特異性識別多肽，在一定濃度范圍內能夠在體外促進成骨細胞的增殖和礦化能力，據分析，其可能機制是該特異性多肽能夠促進成骨細胞定向趨化及其增殖，從而最終加速骨愈合及骨結合的發生和發展，其最終的作用機制還有待進一步深入研究。在此實驗基礎上，課題組擬將10-8～10-4mol/L有效濃度的該特異性多肽結合到鈦種植體表面，再從體外、體內研究其骨結合的生物學效應，以此為生物材料表面的生物化改性研究提供基礎。

［1］ Giannobile W V.Periodontal tissue engineering by growth factors［J］.Bone，1996，19（1）：235-45.

［2］ Florencio-Silva R，Sasso G R，Sasso-Cerri E，et al.Biology of Bone Tissue：Structure，Function，and Factors That Influence Bone Cells［J］.Biomed Res Int，2015，2015：421746.

［3］ 徐苓著.骨質疏松癥［M］.上海：上海科學技術出版社，2011：15-7.

［4］ Birnbaum R S，Bowsher R R，Wiren KM.Changes in IGF-1 and-IIexpression and secretionduring the proliferation and differentiation of normal ratosteoblasts［J］.JEndocrinology，1995，144（2）：251-9.

［5］ Horner A，Bord S，Kemp P，et a1.Distribution of platelet-derived growth factor（PDGF）a chain mRNA，protein，and PDGF-a receptor in rapidly forming human bone［J］.Bone，1996，19（4）：353-62.

［6］ Li JY，Zheng LW，Ma L，etal.Effectof Fluoride-Modified Titanium Surface on Early Adhesion of Irradiated Osteoblasts［J］.Biomed Res Int，2015，2015：219752.

［7］ Smith G P.Filamentous fusion phage：novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface［J］.Science，1985，228（4705）：1315-7.

［8］ Ullman C G，Frigotto L，Cooley R N.In vitro methods for peptide display and their applications［J］.Brief Funct Genomics，2011，10（3）：125-34.

［9］ LoiM，Di Paolo D，Soster M，et al.Novel phage display-derived neuroblastoma-targeting peptides potentiate the effectof drug nanocarriers in preclinical settings［J］.JControl Release，2013，170（2）：233-41.

The experimental study of effect of the peptide that specifically bind to osteoblasts on proliferation and m ineralization of human calvarial osteoblasts in vitro

Qian Haiyan，Chen Huimin，Du Mingliang，et al
（Stomatologic College&Hospital，Anhui Medical University，Key Laboratory of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effect of the peptide that specifically bind to osteoblasts on proliferation and mineralization of human calvarial osteoblasts in vitro.MethodsHuman calvarial osteoblastswere routting cultured which were divided into 6 groups including experimental groups containing the peptide at various concentrations（10-4，10-5，10-6，10-7，10-8mol/L）and a control group.The proliferative activity was examined by MTT，alkaline phosphatase activity was examined by ultraviolet spectrophotometry，the degree of cellmineralization was examined by alizarin red staining and semi-quantitative analysis，and RT-QPCR testwas used to detect RNA level of OCN.ResultsCompared with the control group，the proliferation and alkaline phosphatase activity in different peptide groups were increased（P＜0.05），and the maximum response was obtained with 10-5mol/L and 10-4mol/L.Alizarin red staining cells cultured for 14 and 21 d，the deposition of the calcium in experimental group（10-5mol/L）were higher than the control group，but there was no statistically significant difference.The results of RT-QPCR test showed thatmRNA level of OCN in experimental groupswasmuch higher than the control group（P＜0.05）.ConclusionThe peptide that specifically bind to osteoblasts in the concentrations of 10-8mol/L to 10-4mol/L could promote the proliferation and mineralization of human calvarial osteoblasts in vitro，and the best concentration is 10-5mol/L.

the peptide that specifically bind to osteoblasts；human calvarial osteoblasts；proliferation；mineralization

R 318-33

A

1000-1492（2016）03-0337-04

時間：2016/1/28 14：23：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.012.html

2015-12-21接收

國家自然科學基金（編號：81170993）

安徽醫科大學口腔醫學院，安徽醫科大學附屬口腔醫院，

安徽省口腔疾病研究中心實驗室，合肥 230032

錢海燕，女，碩士研究生；

吳明月，男，副教授，副主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：wumingyue321@126.com