利用果蠅模型探討SCA3/M JD與PD發病機制的相關性

崔 瑩，李清華，韋荔莉，胡艷梅，林小慧，陳梅玲

利用果蠅模型探討SCA3/M JD與PD發病機制的相關性

崔 瑩1，李清華2，韋荔莉2，胡艷梅1，林小慧2，陳梅玲2

目的探討脊髓小腦性共濟失調3型/馬查多—約瑟夫疾病（SCA3/MJD）與帕金森疾病（PD）在發病機制中的相關性。方法利用經典的GAL4/UAS系統，使用MHC-GAL4啟動子，使毒性蛋白質片段（SCA3tr-Q78）特異性地于果蠅飛行肌中表達，構建MHC-GAL4/UAS系統的SCA3/MJD果蠅疾病模型。同樣使用MHC-GAL4啟動子，構建可導致常染色體隱性遺傳性PD的致病基因PINK1無效突變的果蠅，得到經典的PD果蠅模型——PINK1B9。結果兩種疾病模型果蠅的翅膀異常率均增高，肌肉內線粒體均出現退化，ATP值均明顯降低，線粒體氧化呼吸鏈Complex I的亞基ND42的mRNA及NDUFS3蛋白的表達量均下降。結論同樣作為神經退行性變的SCA3/MJD及PD在果蠅疾病模型中體現出了類似的果蠅表型異常及線粒體功能障礙，類似的發病機制可能為“異病同治”找到理論基礎。

脊髓小腦性共濟失調3型/馬查多一約瑟夫疾病；帕金森疾病；線粒體；果蠅

脊髓小腦性共濟失調3型/馬查多—約瑟夫疾病（spinocerebellar ataxia type 3/Machado Joseph disease，SCA3/MJD）為常染色體顯性遺傳遲發性神經退行性疾病，是由于SCA3基因編碼區存在大于47個由CAG編碼的多聚谷氨酰胺（polyglutamine，polyQ）而引起的［1］。研究［2］證明SCA患者可無明顯的共濟失調癥狀，而以帕金森綜合征為主要臨床表現，且給予多巴胺制劑后治療效果良好。同樣，有研究［3-4］表明維生素K2可以挽救帕金森疾病（Parkinson's disease，PD）模型的表型，且對SCA3轉基因果蠅模型的神經毒性具有抑制作用。PINK1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）是一種PD相關基因，其編碼線粒體相關的絲/蘇氨酸激酶已證實對線粒體自噬、形態及質量控制均有調節作用［5］。過表達PINK1可以挽救SCA3轉基因果蠅模型的線粒體功能［6］。該研究探討在肌球蛋白重鏈-半乳糖調節上游啟動子元件/上游激活序列（myosin heavy chain-galactose-regulated upstream promoter element 4/upstream activation sequence，MHC-GAL4/ UAS）系統中SCA3轉基因果蠅模型與PD轉基因果蠅模型在表型上的對比，并檢測兩者線粒體功能缺陷及分子發病機制的相關性。

1 材料與方法

1.1 主要材料果蠅品系：W1118、UAS-SCA3tr-Q78、UAS-SCA3tr-Q27、MHC-GAL4購自美國Bloomington果蠅中心。UAS-PINK1B9由中南大學醫學遺傳學國家重點實驗室惠贈。戊二醛（天津市科密歐化學試劑有限公司），HClO4（天津市科密歐化學試劑有限公司），KOH（天津市科密歐化學試劑有限公司）。顯微鏡H-7650、高效液相色譜儀（德國Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1果蠅雜交

1.2.1.1構建UAS-SCA3tr-Q27/+；MHC-GAL4/ +的果蠅 將UAS-SCA3tr-Q27的雄果蠅與MHCGAL4的處女蠅雜交，收取F1代雄果蠅，其基因型為UAS-SCA3tr-Q27/+；MHC-GAL4/+的目的果蠅，即為與SCA3/MJD轉基因果蠅相對應的正常對照組果蠅。

1.2.1.2構建UAS-SCA3tr-Q78/+；MHC-GAL4/ +的果蠅 將UAS-SCA3tr-Q78的雄果蠅與MHCGAL4的處女蠅雜交，收取F1代雄果蠅，其基因型為UAS-SCA3tr-Q78/+；MHC-GAL4/+的目的果蠅，即為SCA3/MJD疾病組果蠅。

1.2.1.3構建W1118/+；MHC-GAL4/+的果蠅將W1118的雄果蠅與MHC-GAL4的處女蠅雜交，收取F1代雄果蠅，即基因型為W1118/+；MHCGAL4/+的目的果蠅，即為與PINK1B9PD轉基因果蠅相對應的正常對照組果蠅。

1.2.1.4構建PINK1B9/y；MHC-GAL4/+的果蠅將PINK1B9/FM6的處女蠅與MHC-GAL4的雄性果蠅雜交，收取F1代雄果蠅，即基因型為PINK1B9/y；MHC-GAL4/+，即為PD疾病組果蠅。

1.2.2數據采集

1.2.2.1果蠅形態學檢測 觀察4組實驗果蠅體態：UAS-SCA3tr-Q27/+；MHC-GAL4/+，UAS-SCA-tr-Q78/+；MHC-GAl4/+，W1118/+；MHC-GAL4/ +，UAS-PINK1B9/+；MHC-GAL4/+。

1.2.2.2果蠅線粒體觀察 果蠅分組同1.2.2.1，每組隨機挑選第5天雄性果蠅5只，固定于2.5%的戊二醛。于顯微鏡H-7650（15 000×）下直接觀察果蠅胸部間接飛行肌肉的線粒體形態。

1.2.2.3果蠅ATP值檢測 果蠅分組同1.2.2.1取第5天雄性果蠅，每組取10 mg果蠅胸部組織（約50只果蠅胸部組織）；在液氮中研磨，得到果蠅胸部組織，并加入200μl HClO4繼續研磨；研磨后3 500 r/min離心15 min，取上清液，緩慢加入0.2 mol/L KOH，將樣品pH調至7.5，3 500 r/min離心15 min；準備新的EP管移入上清液進行樣品制備。此后，將樣品在高效液相色譜儀上進行ATP水平檢測。該試驗獨立重復3次。

1.2.2.4果蠅mRNA水平檢測 果蠅分組同1.2. 2.1，用實時熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-Time PCR）檢測MHCGAL4/UAS系統的正常對照果蠅組及SCA3/MJD與PD疾病果蠅組中ND42 mRNA表達水平。取第5天的雄性果蠅胸部10 mg（約50只果蠅胸部組織），提取總RNA。用primer 5.0軟件設計引物，合成18s（內參）、ND42引物，由Invitrogen有限公司合成，進行全定量PCR，檢測上述果蠅品系ND42的mRNA表達水平。具體引物序列如下：18s上游：5′-TCTAGCAATATGAGATTGAGCAATAAG-3′，下游：5′-AATACACGTTGATACTTTCATTGTAGC-3′；ND42上游：5′-CGTTTCGATGTCCCGGAGCT-3′，下游：5′-GTCTGCATTGTAGCCAGGAC-3′

1.2.2.5Western blot檢測煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氧酶鐵-硫蛋白3（NADH dehydrogenase［ubiquinone］iron-sulfur protein 3，NDUFS3）蛋白的表達果蠅分組同1.2.2.1，檢測MHC-GAL4/UAS系統的正常對照果蠅組及SCA3/MJD與PD疾病果蠅組中NDUFS3蛋白表達水平。取第5天的雄性果蠅胸部10 mg（約50只果蠅胸部組織），用RIPA裂解液提取總蛋白。配制12%SDS丙烯酰胺凝膠，將蛋白與5×Loading Buffer混合后上樣，使用50 mA恒流電泳。將蛋白轉至PVDF膜上（恒壓150 V，1 h）。用5%脫脂牛奶將膜封閉2 h后用TBST沖洗1次。一抗以工作液濃度1∶1 000，4℃孵育過夜，加入辣根過氧化酶標記的二抗（NDUFS3為鼠抗1∶1 000；βactin為鼠抗1∶1 000）孵育1 h，用ECL發光劑壓膠片發光、顯影。

1.3 統計學處理利用SPSS 17.0統計軟件進行分析，實驗數據采用-x±s表示，組間計量資料比較采用成組設計的t檢驗。

2 結果

2.1 SCA3/MJD轉基因果蠅模型與PD轉基因果蠅模型將人類SCA3/MJD致病的外源基因UASSCA3tr-Q78轉入果蠅基因組內，構建出SCA3/MJD轉基因果蠅模型。當這種模型在MHC-GAL4肌肉啟動子的啟動下，使毒性蛋白特異地在肌肉組織中表達時，果蠅表現出翅膀表型的異常及運動能力的缺陷。與表達正常長度CAG重復序列的UASSCA3tr-Q27的正常對照組果蠅相比，果蠅翅膀出現豎立、分叉、下垂等異常現象。這種果蠅肌肉功能受損的情況同樣出現于PINK1基因敲除的PD果蠅轉基因果蠅模型——PINK1B9果蠅模型中，見圖1。

2.2 SCA3/MJD轉基因果蠅模型與PD轉基因果蠅模型的ATP水平比較SCA3/MJD轉基因果蠅模型與PD轉基因果蠅模型的ATP水平均比相對應的正常對照組明顯降低，差異有統計學意義（t1= 6.252，P1＜0.01；t2=5.436，P2＜0.01）。見圖2。

2.3 SCA3/MJD轉基因果蠅與PD轉基因果蠅模型的肌肉線粒體的觀察透射電鏡下觀察顯示，SCA3/MJD轉基因果蠅線粒體與正常對照組相比，線粒體表現出過度膨脹的形態、線粒體形態不分明，融合在一起。同樣地PD轉基因果蠅與正常對照組果蠅相比也表現出線粒體膨脹的形態。見圖3。

2.4 SCA3/MJD轉基因果蠅與PD轉基因果蠅模型的線粒體功能相關指標的檢測與正常對照組相比，兩種疾病組的ND42 mRNA水平及NDUFS3蛋白表達量均明顯降低（t3=3.292，P3＜0.05；t4= 3.644，P4＜0.05）。見圖4。

3 討論

SCA3是SCA中最常見的亞型，在中國人群中，該型幾乎占所有SCA3患者的50%［7-8］。SCA3/ MJD致病基因編碼區內具有異常CAG三核苷酸重復序列，正常重復次數在13～36，而SCA3/MJD患者可高達62～82次。將重復78次的三核苷酸CAG的序列的cDNA經PUAST載體整合入果蠅胚胎中，構建出表達突變蛋白SCA3tr-Q78的果蠅［9］。選用在肌肉組織中特異性表達的MHC-GAL4啟動子啟動［10］，使突變蛋白的毒性在果蠅的肌肉中表達，SCA3/MJD轉基因果蠅表現出異常的翅膀叉開、豎起、下垂的異常形態。由于SCA3在臨床上除了以小腦性共濟失調、眼球運動障礙、視神經萎縮、錐體束征等的表現外，國內外均有報道提出，SCA3/MJD和PD在臨床表現上具有相似性，發病部位也具有重疊性，在基因診斷出的SCA3/MJD的家系中出現了臨床表現為帕金森病癥狀的患者［11］。且對于此類疾病確切的發病機制目前尚不清楚，也無任何特殊的治療方法。已經有大量的研究［12-13］表明，由帕金森相關基因PINK1突變導致的PD果蠅模型明顯地表現出了果蠅肌肉組織的退化、線粒體功能障礙的致病特點。研究［14］證明SCA患者可無明顯的共濟失調癥狀而以帕金森綜合征為主要臨床表現，且給予多巴胺制劑后治療效果良好。另外有研究［15］表明，維生素K2已經被證實可以作為類似泛醌的電子傳遞鏈重要組分。可以挽救PD轉基因果蠅PINK1B9的表型及線粒體功能。國內也有研究［16］證實了，維生素K2同樣可以挽救SCA3/MJD轉基因果蠅的神經毒性。且過表達帕金森相關基因PINK1可以挽救SCA3/MJD轉基因果蠅的線粒體功能［17］。這些研究均表明SCA3與PD的發病機制有著相似性。但是具體的發病機制的相關性比較尚不明確。本研究顯示SCA3/MJD轉基因果蠅與PD轉基因果蠅一樣在MHC-GAL4啟動子啟動后具有相似的翅膀異常表現。肌肉中的線粒體也同樣表現為過度膨脹的形態。體現線粒體功能的ATP水平也同樣表現為疾病組明顯比相應的正常對照組降低。且SCA3/MJD的線粒體功能障礙不僅僅體現在已有研究［18-19］所表明的mtDNA表達的降低及線粒體氧化呼吸鏈Complex II的功能受損，本研究也表明SCA3/MJD轉基因果蠅中線粒體氧化呼吸鏈Complex I的亞基ND42的mRNA表達同PINK1基因突變所致的PD一樣表達降低；Complex I的組分NDUFS3蛋白的表達量也同樣明顯降低。本研究顯示，對這兩種神經退行性變的轉基因果蠅模型SCA3/MJD和PINK1B9的發病機制的相關性研究，得到了這兩種疾病模型無論在表型上還是在線粒體功能異常上具有一致的表現，也就能夠解釋可以提高線粒體電子傳遞鏈水平的維生素K2能夠同樣抑制SCA3/MJD及PD轉基因果蠅的神經毒性，及過表達PINK1不僅可以挽救PINK1B9轉基因果蠅的表型，也同時可以挽救SCA3/MJD轉基因果蠅線粒體功能的原因。為同樣類型發病機制的神經退行性疾病能夠達到“異病同治”找到理論基礎。

［1］ Jacobi H，Bauer P，Giunti P，etal.The natural history of spinocerebellar ataxia type 1，2，3，and 6：a 2-year follow-up study［J］. Neurology，2011，77（11）：1035-41.

［2］ 宋興旺，郭紀鋒，楊 茜，等.表現為帕金森綜合征的SCA3/ MJD一家系臨床及基因突變研究［J］.中華內科雜志，2006，45（10）：841-2.

［3］ Vos M，Esposito G，Edirisinghe JN，et al.Vitamin K2isamitochondrial electron carrier that rescues pink1 deficiency［J］.Science，2012，336（6086）：1306-10.

［4］ 韋荔莉，陳梅玲，林小慧，等.維生素K2對SCA3/MJD轉基因果蠅的神經保護作用研究［J］.華夏醫學，2014，27（1）：1 -4.

［5］ Pridgeon JW，Olzmann JA，Chin L S，etal.PINK1 protectsagainst oxidative stress by phosphorylating mitochondrial chaperone TRAP1［J］.PLoSBiol，2007，5（7）：e172.

［6］ 曾愛源，李 瓊，黃 強，等.過表達PINK1改善SCA3/MJD轉基因果蠅模型的線粒體功能［J］.中國生物化學與分子生物學報，2015，31（1）：88-95.

［7］ Bossy-Wetzel E，Schwarzenbacher R，Lipton SA.Molecular pathways to neurodegeneration［J］.Nat Med，2004，10 Suppl：S2-9.

［8］ Jiang H，Tang B，Xia K，et al.Spinocerebellar ataxia type 6 in Mainland China：molecular and clinical features in four families［J］.JNeurol Sci，2005，236（1-2）：25-9.

［9］ Warrick JM.Ataxin-3 suppresses polyglutamine neurodegeneration in Drosophila by a ubiquitin-associated mechanism［J］.Mol Cell，2005，18（1）：37-48.

［10］Takeyama K，Ito S，Yamamoto A，et al.Androgen-dependent neurodegeneration by polyglutamine-expanded human androgen receptor in Drosophila［J］.Neuron，2002，35（5）：855-64.

［11］Züchner S，Vance JM.Mechanisms of disease：a molecular genetic update on hereditary axonal neuropathies［J］.Nat Clin Pract Neurol，2006，2（1）：45-53.

［12］Geisler S，Holmstr?K M，Treis A，et al.The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations［J］. Autophagy，2010，6（7）：871-8.

［13］Park J.The PINK1-Parkin pathway is involved in the regulation of mitochondrial remodeling process［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，378（3）：518-23.

［14］Rahman M S.Genetic testing for spinocerebellar ataxias in patients diagnosed as Parkinson′s disease in Bangladesh［J］.Mymensingh Med J，2015，24（1）：44-51.

［15］Vos M.Vitamin K2is amitochondrial electron carrier that rescues pink1 deficiency［J］.Science，2012，336（6086）：1306-10.

［16］韋荔莉，陳梅玲，林小慧，等.維生素K2對SCA3/MJD轉基因果蠅的神經保護作用研究［J］.華夏醫學，2014，27：1-4.

［17］Yang Y，Ouyang Y，Yang L，et al.Pink1 regulatesmitochondrial dynamics through interaction with the fission/fusion machinery［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2008，105（19）：7070-5.

［18］La?o M N，Oliveira CR，Paulson H L，et al.Compromised mitochondrial complex II in models of Machado-Joseph disease［J］. Biochim Biophys Acta，2012，1822（2）：139-49.

［19］Yu Y C，Kuo C L，ChengW L，et al.Decreased antioxidant enzyme activity and increased mitochondrial DNA damage in cellular models of Machado-Joseph disease［J］.JNeurosci Res，2009，87（8）：1884-91.

Research on the correlated pathogenisis between SCA3/M JD transgenic Drosophila models and PD transgenic Drosophila models

Cui Ying1，Li Qinghua2，Wei Lili2，et al
（1Clinical College of Guilin Medical University，Guilin 541004；2Dept of Neurology，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001）

ObjectiveTo reveal the correlated pathogenisis between Spinocerebellar ataxia type 3（SCA3）/MachadoJoseph disease（MJD）and Parkinson′s Disease（PD）.MethodsHere，using the classicalmodel of GAL/UAS system，and the MHC-GAL4 promotor tomake the pathogenic protein fragment（SCA3tr-Q78）expressed in Drosophila muscles，thus SCA3/MJD transgenic Drosophilamodelswere constructed.Using the same approach，we constructed the classical PD transgenic Drosophila models—PINK1B9which was dominantly modified PD related gene PINK1 nullmutant.ResultsThe two diseasemodels exhibited similar abnormalwing posture，the degraded mitochondria in muscle fibers and the decreased ATP levels.In the diseasemodels，the expression ofmitochondrial oxidative respiratory chain complex Isubunit ND42mRNA decreased and the expression of NDUFS3 protein reduced which also morked the function of complex I.ConclusionThe two neurodegenerative diseases SCA3/MJD and PD show the similar abnormal phenotypes and the mitochondrial dysfunction.The similar pathogenisismay raise the theoretical basis for“the same cure for different diseases”.

SCA3/MJD；PD；mitochondria；Drosophila

Q 5；R 741

A

1000-1492（2016）03-0341-05

時間：2016/1/28 14：23：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.014.html

2015-12-29接收

國家自然科學基金（編號：81360488、81160163）；廣西自然科學基金項目（編號：2012GXNSFAA053104、2013GXNSFAA019110）；廣西壯族自治區研究生教育創新計劃資助項目（編號：YCSZ2014208）

1桂林醫學院臨床學院，桂林 541004

2桂林醫學院附屬醫院神經內科，桂林 541001

崔 瑩，女，碩士研究生；

陳梅玲，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：cmmling@sina.com.cn