PEDF對肺腺癌A549細胞遷移、侵襲能力和轉移相關蛋白表達水平的影響

程 宇，束 軍，徐 勝，李曉峰

PEDF對肺腺癌A549細胞遷移、侵襲能力和轉移相關蛋白表達水平的影響

程 宇，束 軍，徐 勝，李曉峰

目的觀察色素上皮衍生因子（PEDF）對肺腺癌A549細胞遷移、侵襲能力以及對轉移相關蛋白如纖維連接蛋白（FN）和基質金屬蛋白酶9（MMP-9）表達水平的影響。方法設不加PEDF的肺腺癌A549細胞為陰性對照組，PEDF干預組細胞分別加入180、360和720 nmol/L PEDF；Transwell檢測PEDF對A549細胞遷移和侵襲能力的影響；半定量RT-PCR法檢測PEDF對FN、MMP-9mRNA表達水平的影響；ELISA法檢測PEDF對A549細胞培養上清液中和細胞內的FN、MMP-9蛋白表達水平的影響。結果PEDF干預組的A549細胞遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著低于陰性對照組（P＜0.05），隨著PEDF濃度的增加，遷移和侵襲細胞數逐漸減少（P＜0.05）。各濃度PEDF干預組A549細胞的FN、MMP-9表達水平較陰性對照組顯著降低（P＜0.05），隨著PEDF濃度的增加，FN、MMP-9表達水平逐漸降低（P＜0.05）。結論PEDF在體外能顯著抑制肺腺癌A549細胞的遷移和侵襲能力，能顯著抑制轉移相關蛋白（FN、MMP-9）的表達水平。

色素上皮衍生因子；肺腺癌；轉移；遷移；侵襲

肺癌在惡性腫瘤發病率及死亡率中居于首位。全世界每年新發肺癌病例數為180多萬，占所有惡性腫瘤的13%；因肺癌導致的死亡患者近160萬，占所有惡性腫瘤死亡的19.4%［1］。轉移是肺癌患者預后不良的重要因素，對其轉移能力的研究對于肺癌患者的治療和預后有非常重要的意義。腫瘤的轉移是有多步驟的復雜過程，其中腫瘤細胞和細胞外基質（extracellularmatrix，ECM）之間的相互作用在介導和調節腫瘤的轉移中起重要作用［2］。纖維連接蛋白（fibronectin，FN）是細胞外基質的重要組成部分，參與細胞黏附、遷移、侵襲和腫瘤轉移。同時，基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）介導的ECM的降解對腫瘤的生長和轉移有重要意義［3］。色素上皮衍生因子（pigment epithelial-derived factor，PEDF）在體內生理和病理過程中有多種活性，包括神經營養、抗血管生成、抗腫瘤生成和抗轉移等。然而，關于PEDF對肺腺癌轉移能力的影響及其機制目前仍不十分清楚。該研究旨在觀察不同濃度PEDF對肺腺癌A549細胞遷移和侵襲能力的影響，以及對轉移相關蛋白FN和MMP-9表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器人肺腺癌細胞株A549由安徽醫科大學基礎醫學院病原微生物實驗室惠贈。人重組PEDF蛋白（美國Peprotech公司）；Matrigel膠（美國B&D公司）；Transwell小室（美國Corning公司）；逆轉錄試劑盒（德國Thermo Scientific公司）；ELISA試劑盒（上海源葉公司）；TRIzol（美國Invitrogen公司）；RT-PCR引物（上海Invitrogen公司）；RPMI-1640培養基、胎牛血清（美國HyClone公司）；DEPC（美國Sigma公司）；DL2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司）；CO2細胞培養箱（美國Thermo公司）；PCR儀（德國Biometra公司）；酶標儀（美國Biotek公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；JD-801凝膠成像分析系統（江蘇捷達科技發展有限公司）；超低溫冰箱（日本Sanyo公司）。

1.2 細胞培養在37℃、5%CO2細胞培養箱中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基常規培養人肺腺癌A549細胞。細胞在培養瓶中貼壁生長，每2～3 d傳代1次。

1.3 PEDF干預組與陰性對照組肺腺癌A549細胞的遷移和侵襲能力

1.3.1A549細胞體外遷移實驗 取生長狀態良好的對數期細胞，PEDF干預組分別加入720、360和180 nmol/L PEDF，陰性對照組不加PEDF，分別作用于A549細胞24 h。常規消化，1 000 r/min離心5 min后，用無血清RPMI-1640培養基調整各組A549細胞密度為2×105/m l，取100μl細胞懸液輕輕加入Trasnwell小室上室，下室中加入10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基600μl，每組3個復孔。置37℃、5%CO2培養箱中孵育24 h。棄上室內培養基，PBS洗兩遍，4%多聚甲醛固定30 min，風干后用0.1%結晶紫染色液染色約30 min，醫用棉棒輕輕擦去小室膜上表面尚未穿過的細胞。在光學顯微鏡（×200）下觀察拍照，400倍高倍鏡下細胞計數，隨機選取6個高倍鏡視野/孔計數穿過底膜的細胞數，即遷移細胞數，取平均值作為結果。實驗重復3次。

1.3.2A549細胞體外侵襲實驗 Martigel膠4℃融化后，用4℃預冷的無血清1640培養基按1∶8比例稀釋Matrigel。在Transwell上室底部加入50 μl稀釋后的Matrigel，鋪滿小室底，置37℃培養箱干燥30 min，待Martrigel膠凝固后，小心棄去上層析出的液態培養基，每個小室再加入50μl無血清1640培養基，置于37℃30 min水化基底膜。后續步驟同Transwell遷移實驗。

1.4 半定量RT-PCR法檢測肺癌A549細胞株中FN、MMP-9mRNA

1.4.1RNA提取 取生長狀態良好的對數期細胞，PEDF干預組分別加入720、360和180 nmol/L PEDF，陰性對照組不加PEDF，分別作用于A549細胞24 h后重懸細胞，加入TRIzol（1 m l），吹打后分別吸入EP管（無RNA酶）中，加入0.2 ml氯仿，劇烈振蕩15 s，冰上靜置3 min，低溫4℃12 000 r/min離心15 min，取上清液至另一EP管中，加入0.5 ml異丙醇溫和混勻，冰上靜置10 min，低溫4℃12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加1 ml75%乙醇（DEPC處理水配制），低溫4℃7 500 r/min離心5 min，棄上清液，室溫放置10 min干燥RNA沉淀，加20μl DEPC水于55℃促溶RNA，-80℃保存。

將樣品稀釋后，利用紫外分光光度計測量各組在260、280 nm波長的吸光度（absorbance，A），計算A260/A280，要求比值在1.8～2.0，表明純度較高。

1.4.2使用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄合成cDNA

各組分別取總RNA 2μg，按照逆轉錄試劑盒說明書進行操作，最后合成cDNA產物總體積為20μl，放入-20℃保存。

1.4.3PCR擴增 以合成的cDNA為模板進行擴增。FN的上游引物為：5′-TCGAGGAGGAAATTCCAATG-3′，下游引物為：5′-CTCTTCATGACGCTTGTGGA-3′，產物長度382 bp；MMP-9的上游引物為：5′-GGCGCTCATGTACCCTATGT-3′，下游引物為：5′-TCAAAGACCGAGTCCAGCTT-3′，產物長度468 bp；GAPDH的上游引物為：5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物為：5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。PCR儀擴增，程序為95℃5 min，（95℃30 s，55℃40 s，72℃50 s）35個循環，72℃10 min，4℃10 min。

1.4.4瓊脂糖凝膠電泳 用0.8%瓊脂糖凝膠分離PCR產物，每100 ml瓊脂糖凝膠溶液加5μl核酸染料。凝膠成像系統觀察結果并進行拍照，分析比較各組FN、MMP-9 mRNA的相對表達量。

1.5 ELISA試劑盒檢測細胞培養上清液和細胞內FN、MMP-9蛋白含量取生長狀態良好的對數期細胞，PEDF干預組分別加入720、360和180 nmol/L PEDF，陰性對照組不加PEDF，分別作用于A549細胞24 h后收集細胞培養上清液，4℃3 000 r/min離心20 min，小心吸取上清液，分裝后于-80℃凍存備用；然后將A549細胞消化離心（1 000 r/min、5 min），重懸后用細胞計數板計數，取含106個細胞的細胞懸液離心，1 m l PBS重懸后，每管細胞加100μl細胞裂解液，用吸管吹打數下，使細胞和裂解液充分接觸，室溫裂解1 h，再用反復凍融方法裂解細胞，隨后4℃12 000 r/min離心30 min，小心吸取上清液，分裝后于-80℃凍存備用。依據ELISA試劑盒說明書操作，對細胞培養上清和細胞內FN、MMP-9蛋白含量進行測定。

1.6 統計學處理實驗結果采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，計量資料用-x±s表示，多組樣本均數間的比較采用單因素方差分析，并進行Levene′s方差齊性檢驗，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以α =0.05作為檢驗水準。

2 結果

2.1 PEDF抑制A549細胞的遷移720、360和180 nmol/L PEDF干預組和陰性對照組的遷移細胞個數分別為（16.44±3.47）、（30.78±2.17）、（42.11±2.36）、（63.67±1.45）個。與陰性對照組相比，各濃度PEDF干預組遷移細胞數均明顯減少，且隨著PEDF濃度的增加，遷移細胞數逐漸減少，各干預組組間差異有統計學意義（F=138.831，P＜0.05）。見圖1。

2.2 PEDF抑制A549細胞的侵襲720、360和180 nmol/L PED干預組和陰性對照組的侵襲細胞個數分別為（11.44±1.58）、（21.67±1.20）、（35.11±2.71）、（44.89±1.07）個。與陰性對照組相比，各濃度PEDF干預組侵襲細胞數均明顯減少，且隨著PEDF濃度的增加，侵襲細胞數逐漸減少，各干預組組間差異有統計學意義（F=208.998，P＜0.05）。見圖2。

2.3 RT-PCR結果720、360和180 nmol/L PEDF干預組和陰性對照組A549細胞中FN mRNA的相對表達量分別是（0.245±0.016）、（0.378± 0.021）、（0.488±0.040）和（0.616±0.026）（圖3），MMP-9 mRNA的相對表達量分別是（0.378± 0.020）、（0.521±0.047）、（0.711±0.016）和（0.859±0.021）（圖4）。與陰性對照組相比，各濃度PEDF干預組A549細胞的FN、MMP-9 mRNA表達水平均明顯降低。隨著PEDF干預劑量增加，FN mRNA表達水平逐漸降低，各干預組間組間差異均有統計學意義（F=100.161，P＜0.05）；MMP-9 mRNA表達水平也逐漸降低（F=156.162，P＜0.05）。見圖5、6。

2.4 ELISA結果比較不同濃度PEDF處理的A549細胞培養上清液中和細胞內FN、MMP-9蛋白濃度，PEDF干預組比陰性對照組A549細胞上清液中和細胞內的FN、MMP-9表達水平均明顯降低。隨著PEDF干預劑量增加，細胞上清液中FN的表達水平逐漸降低，不同劑量PEDF干預組間比較差異均有統計學意義（F=446.055，P＜0.05），細胞內FN的表達水平依次遞減（F=70.117，P＜0.05），細胞上清液中MMP-9的表達水平（F=1 009.000，P＜0.05）和細胞內MMP-9的表達水平（F= 1 719.000，P＜0.05）也均逐漸降低。見表1、2。

3 討論

PEDF廣泛表達于人體組織，包括腦、眼、脊髓、肝、血漿、骨、心臟和肺。PEDF是Tombran-Tink et al［4］首次在人視網膜色素上皮細胞培養液中發現并提取到的多功能糖蛋白，最初被鑒定為人視網膜色素上皮細胞產生的神經元分化因子。

Chen et al［5］發現在肺腺癌A549細胞和肺鱗癌SKMES1細胞中，人重組PEDF蛋白顯著降低肺癌細胞的運動和對細胞外基質的黏附能力；同時在肺癌組織中，PEDF的低表達與淋巴結的轉移和肺癌病人的不良預后密切相關。鄭民等［6］在對50例非小細胞肺癌組織的研究中發現，PEDF陽性組的微血管密度值和在發生遠處轉移的患者中所占的比例均低于PEDF陰性組，表明PEDF可能通過抑制微血管的形成從而抑制肺癌的轉移，PEDF的檢測可能對于判斷肺癌是否發生遠處轉移有一定的意義。研究［7］顯示野生型PEDF和三磷酸突變的PEDF都能夠通過促進內皮細胞的凋亡和腫瘤內血管的破裂來抑制新生血管生成，阻礙內皮細胞和人腦膠質母細胞瘤細胞本身的遷移。He etal［8］發現在Lewis肺癌鼠模型中，腺相關病毒介導的PEDF基因表達能夠在體內抑制其血管生成。馬建梅等［9］發現PEDF能有效抑制肺鱗癌細胞SK-MES-1的侵襲能力，對肺鱗癌的轉移可能發揮潛在的對抗效應。這些結果表明，PEDF可能有潛在的抑制肺癌及其惡性腫瘤轉移的能力。本研究中肺腺癌A549細胞體外遷移實驗和侵襲實驗結果顯示PEDF能有效抑制A549細胞的遷移和侵襲能力。

關于FN和MMPs各自不同功能的研究已有不少，但是關于PEDF與FN、MMPs之間的相互作用仍然知之甚少。關于PEDF與FN相互關系的研究［10］發現，PEDF在體內和體外均能顯著抑制乳腺癌的生長和轉移；并且，PEDF通過p-ERK和p-AKT信號通路下調纖維連接蛋白和隨后的MMP2/MMP9的表達來抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的遷移和侵襲。在前列腺癌、乳腺癌和骨肉瘤等惡性腫瘤細胞中，已發現PEDF特異性下調膜型基質金屬蛋白酶（MT1-MMP）和基質金屬蛋白酶-2（MMP-2），這兩種在轉移性腫瘤中最常見的基質金屬蛋白酶。在對64例膀胱腫瘤組織的關于PEDF與MMP-9相互關系的免疫組化研究［11］中發現，相比于正常尿路上皮，PEDF表達顯著下降，而VEGF和MMP-9的表達顯著升高。在EL-Kras（G12D）小鼠模型中，PEDF缺乏導致的浸潤性胰腺導管腺癌與MMP-2和MMP-9的表達增強有關［12］。PEDF抑制子宮內膜癌細胞的增殖和侵襲，同時，PEDF下調VEGF和MMP-9的表達，上調血小板反應蛋白的表達［13］。本研究中半定量RT-PCR和ELISA實驗結果顯示PEDF能顯著抑制轉移相關蛋白FN和MMP-9的表達水平。

綜上所述，PEDF在肺腺癌A549細胞的轉移過程中發揮拮抗效應。PEDF可作為內源性抗A549細胞生物活性因子，檢測其表達水平可能對判斷肺腺癌患者的預后有一定指導意義。但是，本研究只涉及體外細胞層面，PEDF是否能在體內抑制肺腺癌的轉移，還有待于下一步動物實驗以及臨床試驗的驗證。本研究組前期研究［14-15］表明PEDF可以顯著地抑制A549細胞和NCI-H460細胞的增殖、促進細胞形態變化，并誘導其凋亡。因此，PEDF可以發揮限制肺癌生長和轉移的雙重效應，使其有望成為治療肺癌的新途徑。

［1］ Fitzmaurice C，Dicker D，Pain A，et al.The global burden of cancer 2013［J］.JAMA Oncol，2015，1（4）：505-27.

［2］ Fernandez-Garcia B，Eiro N，Marin L，et al.Expression and prognostic significance of fibronectin and matrix metalloproteases in breast cancer metastasis［J］.Histopathology，2014，64（4）：512-22.

［3］ Gialeli C，Theocharis A D，Karamanos N K.Roles ofmatrixmetalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting［J］.FEBS J，2011，278（1）：16-27.

［4］ Tombran-Tink J，Johnson L V.Neuronal differentiation of retinoblastoma cells induced by medium conditioned by human RPE cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1989，30（8）：1700-7.

［5］ Chen J，Ye L，Zhang L，et al.Themolecular impact of pigment epithelium-derived factor，PEDF，on lung cancer cells and the clinical significance［J］.Int JOncol，2009，35（1）：159-66.

［6］ 鄭 民，梁岳培，王 洋.非小細胞肺癌組織中VEGF、PEDF的表達變化及意義［J］.山東醫藥，2011，51（18）：53-4.

［7］ Konson A，Pradeep S，D′Acunto CW，etal.Pigmentepitheliumderived factor and its phosphomimeticmutant induce JNK-dependent apoptosis and p38-mediatedmigration arrest［J］.JBiol Chem，2011，286（5）：3540-51.

［8］ He SS，Shi H S，Yin T，et al.AAV-mediated gene transfer ofhuman pigmentepithelium-derived factor inhibits Lewis lung carcinoma growth in mice［J］.Oncol Rep，2012，27（4）：1142-8.

［9］ 馬建梅，陳 承，李雪萍.PEDF對肺鱗狀細胞癌SK-MES-1細胞增殖、侵襲和凋亡的影響［J］.吉林大學學報（醫學版），2015，41（1）：6-9+207.

［10］Hong H，Zhou T，Fang S，et al.Pigment epithelium-derived factor（PEDF）inhibits breast cancermetastasis by down-regulating fibronectin［J］.Breast Cancer Res Treat，2014，148（1）：61-72.

［11］Feng CC，Ding Q，Zhang Y F，etal.Pigmentepithelium-derived factor expression is down-regulated in bladder tumors and correlates with vascular endothelial growth factor andmatrixmetalloproteinase-9［J］.Int Urol Nephrol，2011，43（2）：383-90.

［12］Grippo P J，Fitchev P S，Bentrem D J，et al.Concurrent PEDF deficiency and Kras mutation induce invasive pancreatic cancer and adipose-rich stroma in mice［J］.Gut，2012，61（10）：1454 -64.

［13］Guo T，Gu C，Li B.PEDF inhibits growth and invasiveness of endometrial cancer cells in vitro［J］.Panminerva Med，2012，54（4）：299-304.

［14］婁志霞，束 軍，金 程，等.PEDF對人肺腺癌A549細胞增殖與凋亡的影響［J］.安徽醫科大學學報，2014，49（10）：1361-4.

［15］劉正兵，束 軍.色素上皮衍生因子對非小細胞肺癌NCIH460細胞增殖和凋亡的影響［J］.安徽醫科大學學報，2013，48（6）：604-6.

Effects of PEDF on them igration and invasion of lung adenocarcinoma A549 cells and the expression ofmetastatic-related proteins

Cheng Yu，Shu Jun，Xu Sheng，et al
（Dept of Respiratory Medicine，The Fourth Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo observe the effects of pigment epithelium-derived factor（PEDF）on the migration and invasion of human lung adenocarcinoma A549 cell，aswell as the expression ofmetastatic-related proteins including fibronectin（FN）and matrixmetalloproteinase 9（MMP-9）.MethodsA549 cells cultured without PEDF were defined as negative control group，the cells in PEDF intervention group were added 180，360 and 720 nmol/L PEDF，respectively.The effects of PEDF on themigration and invasion of A549 cellwere detected by Transwell assay.The effects of PEDF on the expression of FN and MMP-9 mRNA were detected by semi-quantitative RT-PCR assay，meanwhile the protein of them in supernatant of cell culture and within cellswas detected by ELISA.ResultsThe numbers ofmigrating cells and invasive cells in PEDF intervention group were significantly lower than those in the negative control group（P＜0.05）.With the increase of PEDF concentration，the numbers ofmigrating and invasve cells decreased by degrees（P＜0.05）.The expression of FN and MMP-9 in A549 cellswas significantly lower than that in the control group（P＜0.05）and the expression levelwas remarkably decreased by degreeswith the increase of PEDF concentration（P＜0.05）.ConclusionPEDF can significantly inhibit themigration and invasion of A549 cells in vitro，furthermore，PEDF can significantly inhibit the expression ofmetastasis associated proteins（FN and MMP-9）.

pigment epithelium-derived factor；lung adenocarcinoma；metastasis；migration；invasion

R 734.2；R 73-37

A

1000-1492（2016）03-0345-06

時間：2016/1/28 14：23：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.016.html

2015-12-08接收

安徽省自然科學基金面上項目（編號：1308085MH141）；

安徽醫科大學科研基金資助項目（編號：2010xkj115）

安徽醫科大學第四附屬醫院呼吸內科，合肥 230022

程 宇，女，碩士研究生；

束 軍，男，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：J.Shu @126.com