抑郁大鼠海馬區微管蛋白表達的變化

袁 楊，劉 昊，王海濤，徐愛軍

抑郁大鼠海馬區微管蛋白表達的變化

袁 楊1，劉 昊1，王海濤2，徐愛軍2

目的探索抑郁癥大鼠海馬區磷酸化微管相關蛋白-2（pMAP-2）表達和與之對應組織形態學上的變化。方法將成年大鼠隨機分為對照組、模型組，采用慢性不可預見性溫和應激方法建立抑郁大鼠模型，采用糖水偏好實驗、曠場實驗以及Morris水迷宮對其進行行為學檢測，尼氏染色法觀察海馬神經元形態學改變，Western blot檢測1、7、14、28 d對照組、模型組海馬組織中pMAP-2蛋白表達水平。結果與對照組相比，糖水偏好實驗模型組糖水消耗量和糖水偏好百分比分別降低（P＜0.05），模型組在曠場實驗、中央活動時間、行走總里程、以及直立次數和修飾行為等均降低（P＜0.05），Morris水迷宮模型組相對于對照組平均逃避潛伏期增高（P＜0.05），相比于對照組，CUMS后1 d模型組大鼠海馬p-MAP2蛋白表達較少（P＜0.05），但是從第7天開始持續的高表達（P＜0.05），在14 d時這種高表達到了最高峰（P＜0.05），并且這種增高在第28 d時依然非常明顯（P＜0.05）。與對照組比較，模型組海馬神經元體積萎縮，數量減少。結論pMAP-2在抑郁模型大鼠海馬出現先降低后增高的現象，可能與海馬體積異常變化有關。

抑郁癥；海馬；微管相關蛋白；大鼠

抑郁癥是一種慢性、反復發作的情感性精神疾病，發病率高，危害大，但其具體發病機制未明。影像學研究［1-2］顯示，抑郁癥患者和動物模型大腦海馬區容積明顯減少，其原因可能與海馬神經元凋亡異常增強有關［3］。抑郁癥大鼠海馬神經元出現突起減少、體積萎縮和排列疏松等現象［2］。研究［4］表明，抑郁癥患者海馬區神經元細胞存在可塑性變化。因此，推測抑郁癥海馬區神經元存在細胞骨架改變。微管是細胞骨架的重要成分，其穩定性受微管相關蛋白（microtubule-associated protein，MAPs）的調控［5］。微管相關蛋白2（MAP-2）是研究最多的微管相關蛋白，但其在抑郁癥中的變化目前研究不多。為明確抑郁癥發病過程中MAP-2的改變，該實驗建立大鼠抑郁癥模型，檢測MAP-2及其磷酸化的改變。

1 材料與方法

1.1 材料健康成年SD大鼠60只，（170±20）g，由華北理工大學實驗動物中心（SCXK京2009-0004）提供，適應性飼養1周，飼養條件：23～26℃、晝夜節律（12/12）、自由攝食飲水。pMAP-2兔多克隆抗體（英國Abcam公司）；β-actin小鼠單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.2 分組及動物模型建立將60只SD大鼠分為對照組和模型組，每組各30只。模型組大鼠給予慢性不可預見性溫和應激（CUMS）建立抑郁癥模型。應激包括：禁錮24 h，鼠籠45℃傾斜搖晃15 min，潮濕墊料24 h，冰水游泳（4℃，5 min），熱水游泳（42℃，5 min），禁食禁水24 h，雙耳電擊（每次10 s，間隔50 s總共兩次，0.8 mA），夾尾（位置距尾根1 cm，1 min），明暗交替改變晝夜習性（1 h照明，1 h黑暗，交替持續24 h）。以上應激刺激在22 d內隨機進行，每日1次，同種應激不連續出現。對照組大鼠除不做特殊處理。于應激實驗后1、7、14、28 d分別處死大鼠用于實驗。

1.3 行為學評估每組取15只大鼠進行行為學測試，包括：①糖水偏好實驗測定前禁水禁食24 h，實驗與對照組每籠都放置1%蔗糖水和純凈水各一瓶，測量1 h內兩瓶水的消耗量，糖水偏好率（%）=糖水消耗量/總液體消耗量×100%，計算糖水偏好率；②曠場實驗將大鼠放置曠場中心方格內，通過行為學實驗分析系統計算5 min內大鼠行為學，測試內容包括穿越總路程、中央活動時間、站立次數、修飾行為；③Morris水迷宮實驗觀察3 d時程，記錄大鼠逃避潛伏期。

1.4 Westernblot法檢測pMAP-2蛋白表達取新鮮大鼠腦組織分離海馬，用RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經10%SDS-PAGE電泳，PVDF轉膜，BSA封閉，pMAP-2兔多克隆抗體（1∶1 000）一抗，4℃孵育過夜，羊抗兔IgG（1∶5 000）二抗室溫孵育2 h，ECL顯色。內參照β-actin經歷相同的實驗過程。選取目的條帶光密度比值與內參相應光密度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。

1.5 統計學處理使用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析，數據用-x±s表示，行為學檢測進行獨立樣本t檢驗，多時間點pMAP-2蛋白檢測選取單因素方差分析和LSD檢驗。

2 結果

2.1 糖水偏好實驗對照組大鼠的糖水消耗量與糖水偏好率分別為（42.42±9.31）ml、（71.62± 6.73）%。模型組大鼠的糖水消耗量與糖水偏好率分別為（28.60±4.61）ml、（60.01±2.12）%。與對照組相比，模型組的糖水消耗量與糖水偏好率明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 曠場及Morris水迷宮實驗曠場實驗模型組行走總路、中央活動時間、直立次數和修飾行為分別低于對照組（P＜0.05），Morris水迷宮模型組平均逃避潛伏期高于對照組（P＜0.05）。見表1、圖1。

2.3 尼氏染色對照組大鼠海馬神經元形態規則，排列整齊，胞漿中能夠觀察到豐富致密的尼氏體。模型組海馬神經元數目減少，排列稀疏，有較多的核固縮、胞漿中尼氏體數目明顯減少。見圖2。

2.4 各組大鼠海馬pMAP-2蛋白表達水平根據條帶分析顯示與對照組比較，pMAP-2蛋白在CUMS后1 d蛋白表達低于對照組（P＜0.01），7 d后開始升高（P＜0.01），14 d明顯高于對照組（P＜0.01），28 d仍略高于對照組（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

抑郁癥主要的臨床特征為顯著而持久的心境低落，并伴隨著思維遲緩、意志活動力減弱、認知及軀體運動功能減退等臨床表現，嚴重時可能會伴有自殺傾向，嚴重威脅人們的身心健康。抑郁癥動物模型的建立促進了抑郁癥的基礎研究，本實驗采用CUMS應激方法建立抑郁癥大鼠模型，行為學結果顯示，接受CUMUS應激后模型組大鼠的糖水消耗量和糖水偏好百分比明顯降低，自主與探究行為明顯減少、空間記憶學習能力減退，提示CUMS大鼠能夠很好模擬抑郁癥主要特征。

抑郁癥動物模型［2］，或是抑郁癥患者［6-7］，海馬結構都會出現異常變化，即雙側海馬體積萎縮。為探討抑郁癥大鼠海馬神容積縮小的原因，利用尼氏染色觀察海馬神經元的改變。結果表明，CUMS應激后海馬神經元細胞密度小，排列疏松，細胞核萎縮，突起減少；這可能是抑郁癥患者海馬容積縮小的原因之一。研究［8-9］表明，抑郁癥患者在其經受應激的過程中海馬區存在神經可塑性變化。細胞骨架是維持神經細胞形態結構的重要基礎，當受到應激等相關刺激發生神經可塑性改變時，細胞骨架隨之發生改變。微管是細胞骨架的物質組成，對細胞起支撐作用。微管的聚合、解聚這一過程MAPs調控。研究［9］顯示MAP-2能夠參與神經突起生長和突觸可塑性過程。MAP-2磷酸化后能參與調節微管的結合和解離過程，從而影響微管的穩定［10-11］。本研究檢測了抑郁癥pMAP-2的改變，結果表明CMUS應激后大鼠海馬組織中pMAP-2在應激初期顯著降低，而后7 d后開始升高，14 d達到高峰，28 d回落但依舊高于對照組。因此推測在應激抑郁癥發病過程中，pMAP-2的變化可能影響微管的穩定性，這可能海馬體積改變的原因之一，其在抑郁癥發病中的關系有待于進一步深入的研究。

［1］ 譚川雪，王飛飛，陳林木，等.抑郁癥大鼠海馬CA1區及齒狀回毛細血管的體視學研究［J］.重慶醫科大學學報，2015，25（5）：6-7.

［2］ 徐愛軍，劉 昊，劉 英，等.抑郁癥大鼠海馬體積異常的形態學探討［J］.中風與神經疾病雜志，2014，31（2）：118-20.

［3］ 竇立敏，吳鶴鳴，王 東.慢性應激抑郁模型大鼠海馬凋亡率的不對稱性改變［J］.江蘇醫藥，2015，41（4）：380-2.

［4］ 許委娟，許 毅.抑郁癥與神經可塑性［J］.國際精神病學雜志，2011，38（3）：184-7.

［5］ 林抒豪，石玉秀，韓 芳.細胞凋亡與真核細胞骨架蛋白相關性的研究進展［J］.解剖科學進展，2015，10（2）：207-10.

［6］ Boldrini M，Santiago A N，Hen R，et al.Hippocampal granule neuron number anddentate gyrus volume in antidepressant-treated and untreated major depression［J］.Neuropsychopharmacology，2013，38（6）：1068-77.

［7］ Zannas A S，McQuoid D R，Payne M E，et al.Negative life stress and longitudinal hippocampal volu-me changes in older adultswith and without depression［J］.JPsychiatr Res，2013，47（6）：829-34.

［8］ McEwen B S，Gianaros P J.Stress-and allostasis-induced brain plasticity［J］.Annu Rev Med，2011，62：431-45.

［9］ Tang L，Lu Y，ZhengW，etal.Overexpression of MAP-2 via formation of microtubules plays an important role in the sprouting of mossy fibers in epileptic rats［J］.JMol Neurosci，2014，53（1）：103-8.

［10］Wang Y，Wang Y，Dong J，et al.Developmental hypothyroxinaemia and hypothyroidism limit dendritic growth of cerebellar Purkinje cells in ratoffspring：involvementofmicrotubule-associated protein 2（MAP2）and stathmin［J］.Neuropathol Appl Neurobiol，2014，40（4）：398-415.

［11］Pereno G L，Beltramino C A.Timed changes of synaptic zinc，synaptophysin and MAP2 in medial e-xtended amygdala of epileptic animals are suggestive of reactive neuroplasticity［J］.Brain Res，2010，1328（1）：130-8.

Changes of the expression ofm icrotubule-associated protein in the hippocampus of depressed rats

Yuan Yang1，Liu Hao1，Wang Haitao2，et al
（1Dept of Neurology，Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology，Tangshan 063000；2Dept of Histology and Embryology，College of Basic Medical Sciences，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000）

ObjectiveTo explore themicrotubule-associated protein 2（pMAP-2）expression in hippocampal of the depression rats and the corresponding changes of histomorphology.MethodsThe SD rats were randomly divided into contol group and model group，the depression ratmodelwas produced by giving the chronic unpredictablemild stess（CUMS）.The depressional behabior was examined by useing surose preference test，tail-suspension test and Morriswatermaze.Themorphological change of hippocampal neurons was carried out by Nissl staining.At 1，7，14，28d aftermodeling，the expression of pMAP-2 in hippocampal of control group and model group were detected by the Western Blot.ResultsCompared to control group，the consumption of sucrose and percentage of sucrose preference of rats inmodel group were significantly lower，while in open field test，the totalwalking distance，central activity time，up-right times and grooming behavior in model group were also lower than that in control group（P＜

0.05）.In the Morriswatermaze，themodel group average escape latency period is higher than that in control group（P＜0.05）.Compared with the Sham group，the expression of p-MAP2 in model group was obviously lighter in 1 d after CUMS（P＜0.05），but continuous high expression from 7 d（P＜0.05），reached its highest point in 14 d（P＜0.05），and the high expression in 28 d is still very obvious（P＜0.05）.Compared to control group，the neuroanl body was smaller，and the number of neurons was decreased.ConclusionThe expression level of pMAP-2 protein in the depressionmodel of hippocampus of rats decreases firstly and then increases，which is probably related to the change in the hippocampal volume abnormal of depression.

depression；hippocampus；microtubule-associated protein；rats

R 749

A

1000-1492（2016）03-0355-04

時間：2016/1/28 14：23：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.020.html

2015-12-08接收

國家自然科學基金項目（編號：81201048）

1華北理工大學附屬醫院神經內科，唐山 063000

2華北理工大學基礎醫學院組織胚胎學系，唐山 063000

袁 楊，女，碩士研究生；

劉 昊，女，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：liuhao938@163.com