高濃度葡萄糖對肺腺癌A549細胞生長及VEGF、MMP-2表達的影響

李曉峰，束 軍，程 宇，徐 勝，沈繼龍

高濃度葡萄糖對肺腺癌A549細胞生長及VEGF、MMP-2表達的影響

李曉峰1，束 軍1，程 宇1，徐 勝1，沈繼龍2

目的觀察高濃度葡萄糖對肺腺癌A549細胞生長及血管內皮生長因子（VEGF）、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）表達的影響。方法根據處理條件不同，將A549細胞分為：對照組（無干預）、甘露醇組（25 mmol/L甘露醇）、葡萄糖組（10、20、30、40 mmol/L葡萄糖）、順鉑組（5、10、20、40μmol/ L順鉑）和聯合組（30 mmol/L葡萄糖聯合5、10、20、40 μmol/L順鉑），分別處理48 h后，采用MTT法檢測細胞的增殖率，比較不同組別間細胞增殖率的差異；對照組、葡萄糖組、甘露醇組處理24 h和48 h后，采用半定量RT-PCR法檢測細胞中VEGF、MMP-2的mRNA水平，采用ELISA法檢測細胞培養上清液中VEGF、MMP-2的蛋白濃度，比較不同組別間VEGF、MMP-2的表達水平差異。結果除10 mmol/L葡萄糖組外，葡萄糖組的細胞增殖率均高于對照組（P＜0.05）；相同順鉑濃度下，聯合組的細胞增殖率高于順鉑組（P＜0.05）；與對照組比較，葡萄糖組VEGF、MMP-2表達明顯增強（P＜0.05），且對葡萄糖濃度有一定依賴性，葡萄糖濃度為30 mmol/L時VEGFmRNA、MMP-2的mRNA和蛋白水平達最高值，40mmol/L時VEGF蛋白濃度最高；相同干預條件，48 h細胞的VEGF、MMP-2表達水平高于24 h（P＜0.05）。結論高濃度葡萄糖能促進肺腺癌A549細胞的增殖，增強對順鉑的耐受力及VEGF、MMP-2的表達。

葡萄糖；肺腺癌；生長；血管內皮生長因子；基質金屬蛋白酶-2

肺癌是對人類健康和生命危害最大的惡性腫瘤之一，在全球和我國肺癌的發病率與死亡率都居所有惡性腫瘤之首。研究［1］提示糖尿病能增加肺癌的發生率，尤其在女性糖尿病患者中更為明顯。與空腹血糖正常的肺癌患者比較，空腹血糖濃度大于126 mg/dl的肺癌患者具有更高的死亡率［2］。色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）作為血管增生的抑制因子，不僅能抑制腫瘤新生血管的形成，還能降低腫瘤細胞的增殖和轉移能力［3］。課題組前期研究［4］表明，高濃度的葡萄糖能夠降低肺癌細胞中PEDF的表達。高濃度葡萄糖是否對肺癌細胞的增殖、耐藥及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表達有影響，尚未見報道。該實驗擬在體外條件下通過不同濃度葡萄糖對肺腺癌A549細胞進行干預，觀察細胞的增殖情況和VEGF、MMP-2的表達水平，并且聯用順鉑對細胞進行處理，比較細胞增殖率的變化。

1 材料與方法

1.1 材料A549細胞株由安徽醫科大學基礎醫學院病理生理教研室惠贈；胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司；低糖DMEM培養基購自美國Hy-Clone公司；胰蛋白酶購自上海碧云天生物技術有限公司；DMSO、MTT、葡萄糖、甘露醇購自美國Sigma公司；順鉑購自齊魯制藥有限公司；ELISA試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；RNA isolater、RTPCR第一鏈cDNA合成試劑盒和2×Taq Master Mix均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR所用引物由上海生工生物工程有限公司合成；細胞培養箱購自美國Thermo公司；超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術有限公司；酶標儀購自美國Bio-Tek公司；超速低溫離心機購自美國Scilogex公司；165-4000IEF電泳儀購自美國Bio-Rad公司；DNA Marker（DL 2 000）購自日本TaKaRa公司；D-801凝膠成像分析系統購自江蘇捷達科技發展有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基（含5.6 mmol/L葡萄糖）于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養A549細胞。

1.2.2MTT法檢測葡萄糖及順鉑對A549細胞增殖的影響 實驗分為對照組、甘露醇組、葡萄糖組、順鉑組和聯合組。取對數生長期細胞，0.25%胰酶消化后900 r/min離心5min，棄上清液，加培養液混勻。以6 000個/孔的密度接種于96孔板中，使每孔體積為200μl，邊緣孔加200μl的PBS溶液，并留4孔（只加培養基）作為空白組，以排除系統誤差，培養箱中培養。細胞貼壁后，分別加入不同含量的葡萄糖，使葡萄糖組中葡萄糖終濃度分別為10、20、30、40 mmol/L；分別加入不同含量的順鉑，使順鉑組中順鉑終濃度分別為5、10、20、40μmol/L；加入適量的葡萄糖和順鉑，使聯合組中葡萄糖終濃度均為30 mmol/L，順鉑終濃度分別為5、10、20、40μmol/ L；另設對照組（無干預）和甘露醇組（甘露醇濃度為25 mmol/L）。加藥完畢后，于培養箱中培養48 h。然后，每孔加入20μl MTT溶液，繼續培養4 h，棄去孔內液體，每孔加入150μl DMSO，培養箱中孵育15 min。最后，用酶標儀于570 nm波長處檢測各孔的吸光度（absorbance，A）值。以對照組細胞增殖率為100%，則干預組細胞增殖率（%）=（干預組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）。每次實驗設置6個復孔，重復3次。

1.2.3細胞總RNA的提取及RT-PCR法檢測細胞中VEGF和MMP-2的mRNA水平 取對數期細胞，以3×105個/孔的密度種于6孔板中，細胞貼壁后，分別加入不同含量的葡萄糖，使各孔的葡萄糖終濃度分別為10、20、30、40 mmol/L，另設對照組（無干預）和甘露醇組（甘露醇濃度為25 mmol/L），加藥完畢后，于培養箱中培養24 h和48 h。用PBS洗細胞2遍，每孔加入1 ml RNA isolater，按照說明書提取總RNA，溶解于DEPC處理水后，-80℃長期保存。按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，-20℃保存。VEGF上游引物序列：5′-GAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTC-3′，下游引物序列：5′-CGATCGTTCTGTATCAGTCTTTCC-3′，541、408 bp［5］；MMP-2上游引物序列：5′-CCTGTTTGTGCTGAAGGACA-3′，下游引物序列：5′-GTACTTGCCATCCTTCTCAA-3′，616 bp［6］；β-actin上游引物序列：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物序列：5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′，285 bp。擴增條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58.5℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃徹底延伸7 min，28個循環。用含1%瓊脂糖的凝膠對PCR產物進行電泳分離，并用凝膠成像分析系統進行處理，以β-actin為內參，半定量計算VEGF和MMP-2的mRNA水平。

1.2.4ELISA試劑盒檢測細胞培養上清液中VEGF和MMP-2的蛋白濃度 取對數期細胞，以3 ×105個/孔的密度種于6孔板中，細胞貼壁后，分別加入不同含量的葡萄糖，使各孔的葡萄糖終濃度分別為10、20、30、40 mmol/L，另設對照組（無干預）和甘露醇組（甘露醇濃度為25 mmol/L），加藥完畢后，于培養箱中培養24 h和48 h。收集細胞上清液3 000 r/min離心15 min，小心吸取上清液，分裝后凍存于-80℃。按照試劑盒說明書操作，檢測上清液中VEGF和MMP-2的蛋白濃度。

1.3 統計學處理采用SPSS17.0軟件進行分析，計量資料以-x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（SNK檢驗進行兩兩比較），兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 高濃度葡萄糖能提高A549細胞增殖力及對順鉑的耐受力對照組的細胞增殖率為100%，葡萄糖組的細胞增殖率分別為（105.68±7.45）%、（115.28±5.79）%、（134.57±7.17）%、（129.71± 11.37）%，甘露醇組的細胞增殖率為（101.95+ 4.30）%，6組間細胞增殖率不完全相等（F= 60.170，P＜0.05），與對照組比較，20、30、40 mmol/ L葡萄糖組的細胞增殖率明顯升高（P＜0.05），30、40 mmol/L葡萄糖組較20 mmol/L組明顯升高（P＜0.05），30、40 mmol/L葡萄糖組間差別無統計學意義，見圖1。順鉑組的細胞增殖率均低于對照組，且隨著順鉑濃度的增大，細胞增殖率逐漸降低，各組間差別均有統計學意義（F=326.78，P＜0.05），相同濃度順鉑干預下，聯合組的細胞增殖率均高于順鉑組（P＜0.05），見圖2。

2.2 高濃度葡萄糖能提高A549細胞中VEGF、MMP-2的mRNA水平與對照組比較，高濃度葡萄糖干預細胞24 h和48 h后，細胞中VEGF、MMP-2的mRNA水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。相同時間點，隨著葡萄糖濃度的升高，VEGF、MMP-2的mRNA水平呈逐漸升高的趨勢（VEGF：F24h=71.401，F48h=58.091，P＜0.05；MMP-2：F24h=31.647，F48h=46.225，P＜0.05），在30 mmol/L葡萄糖干預時達到最高值，而后有所下降；與對照組比較，甘露醇組MMP-2的表達未見明顯變化，甘露醇組VEGF的表達明顯增強（P＜0.05）；相同干預條件下，與24 h比較，48 h兩mRNA的水平明顯升高（P＜0.05），見圖3、4。

2.3 高濃度葡萄糖能提高A549細胞上清液中VEGF、MMP-2的蛋白濃度與對照組比較，高濃度葡萄糖處理細胞24 h和48 h后，細胞上清液中VEGF、MMP-2的蛋白濃度明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。相同時間點，隨著葡萄糖濃度的升高，細胞上清液中VEGF的蛋白濃度逐漸升高（F24h=201.370，F48h=162.531，P＜0.05），在40 mmol/L葡萄糖干預時達最高水平；甘露醇組VEGF濃度高于對照組（P＜0.05）；相同濃度葡萄糖干預細胞，48 h上清液中VEGF濃度明顯高于24 h（P＜0.05），見表1。相同時間點，隨著葡萄糖濃度的升高，MMP-2的蛋白濃度逐漸升高（F24h=35.226，F48h=41.301，P＜0.05），在30 mmol/L葡萄糖干預時達到最高值，40 mmol/L葡萄糖時有所下降；與對照組比較，甘露醇組MMP-2濃度無明顯變化；相同濃度葡萄糖干預細胞，48 h上清液中MMP-2濃度明顯高于24 h（P＜0.05），見表2。

3 討論

葡萄糖作為人體最基本的供能物質，在生命活動中發揮著重要的作用，然而，近來研究［7-10］顯示高濃度的葡萄糖對腫瘤的發生和進展有一定的促進作用。Zhao et al［7］對胃癌患者進行研究，發現合并糖尿病者，更容易出現耐藥，且預后較差，進一步，對胃癌細胞進行不同濃度的葡萄糖處理，發現高濃度的葡萄糖能促進細胞增殖，并能減弱5-氟尿嘧啶的抑制作用。對子宮內膜癌細胞分別進行含1、5、25 mmol/L葡萄糖的培養基培養發現，與5 mmol/L葡萄糖比較，1 mmol/L葡萄糖能使細胞阻滯于G1期，降低細胞的增殖能力，而25 mmol/L葡萄糖可激活AMPK/mTOR/S6和MAPK信號通路，提高細胞的增殖和侵襲能力［8］。此外，高濃度的葡萄糖還能激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促進腫瘤的發生［9］。Inal et al［10］對442例進展期肺癌患者進行回顧性研究發現，在接受以鉑類為基礎的化療藥物的肺癌患者中，與未患糖尿病者比較，合并有糖尿病的患者具有較短的無進展生存期和總生存期。

MMP-2作為基質金屬蛋白酶家族的重要成員，參與細胞外基質的分解，并能增強肺癌細胞的轉移能力［11］，VEGF是最關鍵的促血管生長因子之一，不僅調控正常組織的血管生成，還能促進肺癌組織新生血管的形成［12］，因此VEGF和MMP-2的表達與肺癌的發生和進展有密切的關聯。藥物治療，尤其是以鉑類為基礎的化療藥物，是中晚期肺癌患者的主要選擇，但是，癌細胞的耐藥現象卻嚴重影響化療效果，使肺癌的治療變得困難。

本研究采用較為常見的肺腺癌A549細胞為實驗對象，分別進行不同濃度的葡萄糖和25 mmol/L甘露醇進行干預，結果提示，高濃度的葡萄糖能促進A549細胞的增殖，提高VEGF、MMP-2的表達水平。隨著葡萄糖濃度的提高，葡萄糖對VEGF、MMP-2表達的影響更加明顯，超過一定濃度后作用反而減弱。研究［13］顯示，高濃度葡萄糖作用A549細胞后，能促進活性氧的生成，激活TGF-β1/PI3K/Akt信號通路，從而提高血紅素氧合酶-1的水平，最終增強轉移相關蛋白MMP-9的表達及細胞的侵襲能力。由于MMP-2和MMP-9同屬基質金屬蛋白酶家族，具有相似的結構和功能，都參與腫瘤的轉移，本研究結果與研究［13］一致，均證明高濃度葡萄糖與肺腺癌的轉移有關。VEGF作為重要的促血管生成因子，與PEDF作用相反，本研究結果提示高濃度葡萄糖能提高A549細胞中VEGF水平，前期研究［4］顯示高濃度葡萄糖能降低A549細胞中PEDF水平，兩次研究中高濃度葡萄糖對A549細胞的作用一致。Seebacher et al［14］發現高濃度葡萄糖能通過P-糖蛋白提高A549細胞對抗腫瘤藥阿霉素的抵抗力，本研究亦顯示30 mmol/L的葡萄糖能提高肺癌細胞對化療藥物順鉑的耐受力，推測高濃度葡萄糖可能與A549多重耐藥有關。實驗中，25 mmol/L的甘露醇能一定程度地提高A549細胞中VEGF的轉錄和翻譯水平，考慮VEGF的表達不僅與葡萄糖的濃度有關，還可能受滲透壓變化的影響［15］。

綜上所述，高濃度的葡萄糖能提高肺腺癌A549細胞的增殖力、對順鉑的耐受力及VEGF、MMP-2的表達。

［1］ Lee JY，Jeon I，Lee JM，et al.Diabetesmellitus as an independent risk factor for lung cancer：ameta-analysis of observational studies［J］.Eur JCancer，2013，49（10）：2411-23.

［2］ Luo J，Chen Y J，Chang L J.Fasting blood glucose level and prognosis in non-small cell lung cancer（NSCLC）patients［J］. Lung Cancer，2012，76（2）：242-7.

［3］ Becerra S P，Notario V.The effects of PEDF on cancer biology：mechanisms of action and therapeutic potential［J］.NatRev Cancer，2013，13（4）：258-71.

［4］ 金 程，束 軍，婁志霞，等.不同濃度葡萄糖對肺腺癌細胞PEDF表達的影響［J］.安徽醫科大學學報，2014，49（8）：1084 -7.

［5］ Kumar S，Witzig T E，Timm M，et al.Expression of VEGF and its receptors by myeloma cells［J］.Leukemia，2003，17（10）：2025-31.

［6］ Monteleone G，Caruso R，Fina D，et al.Control ofmatrixmetalloproteinase production in human intestinal fibroblasts by interleukin 21［J］.Gut，2006，55（12）：1774-80.

［7］ Zhao W，Chen R，Zhao M，et al.High glucose promotes gastric cancer chemoresistance in vivo and in vitro［J］.Mol Med Rep，2015，12（1）：843-50.

［8］ Han J，Zhang L，Guo H，et al.Glucose promotes cell proliferation，glucose uptake and invasion in endometrial cancer cells via AMPK/mTOR/S6 and MAPK signaling［J］.Gynecol Oncol，2015，138（3）：668-75.

［9］ Chocarro-Calvo A，Garcia-Martinez JM，Ardila-Gonzalez S，et al.Glucose-induced beta-catenin acetylation enhances Wnt signaling in cancer［J］.Mol Cell，2013，49（3）：474-86.

［10］Inal A，Kaplan M A，Kucukoner M，et al.Is diabetesmellitus a negative prognostic factor for the treatment of advanced non-smallcell lung cancer？［J］.Rev Port Pneumol，2014，20（2）：62-8.

［11］Kuo H Y，Huang Y S，Tseng C H，et al.PML represses lung cancermetastasis by suppressing the nuclear EGFR-mediated transcriptional activation of MMP2［J］.Cell Cycle，2014，13（19）：3132-42.

［12］AlevizakosM，Kaltsas S，Syrigos K N.The VEGF pathway in lung cancer［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2013，72（6）：1169-81.

［13］Kang X，Kong F，Wu X，et al.High glucose promotes tumor invasion and increasesmetastasis-associated protein expression in human lung epithelial cells by upregulating heme oxygenase-1 via reactive oxygen species or the TGF-β1/PI3K/Akt signaling pathway［J］.Cell Physiol Biochem，2015，35（3）：1008-22.

［14］Seebacher N A，Richardson D R，Jansson P J.Glucosemodulation induces reactive oxygen species and increases P-glycoproteinmediated multidrug resistance to chemotherapeutics［J］.Br J Pharmacol，2015，172（10）：2557-72.

［15］Doronzo G，Viretto M，Russo I，et al.Effects of high glucose on vascular endothelial growth factor synthesis and secretion in aortic vascular smooth muscle cells from obese and lean Zucker rats［J］. Int JMol Sci，2012，13（8）：9478-88.

Effects of high glucose on the grow th and VEGF and MMP-2 expression of lung adenocarcinoma A549 cells

Li Xiaofeng，Shu Jun，Cheng Yu，et al
（Dept of Respiratory Medicine，The Fourth Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo observe effects of high glucose on the growth and expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）and matrixmetalloproteinase-2（MMP-2）of lung adenocarcinoma A549 cells.MethodsAccording to the intervening factors，A549 cells were grouped as follows：control group（no intervention），mannitol group（25 mmol/Lmannitol），glucose groups（10，20，30，40 mmol/L glucose），cisplatin groups（5，10，20，40 μmol/L cisplatin），and combination groups（30 mmol/L glucosewith 5，10，20，40μmol/L cisplatin）.Cell proliferation rates of different groupswere evaluated by MTT assay after 48 hours′intervention.For the control group，glucose groups and mannitol group，levels of VEGF and MMP-2 mRNA were examined by semi-quantitative RTPCR and concentrations of VEGF and MMP-2 protein in supernatantwere determined by ELISA at24 and 48 hours after intervention，and then compared with each other.ResultsExcept for the group of 10 mmol/L glucose，glucose groups had higher proliferation rates than the control group（P＜0.05）.At the same concentration of cisplatin，combination groups had higher proliferation rates than the cisplatin groups（P＜0.05）.Compared with the control group，the expression of VEGF and MMP-2 in glucose groupswas remarkably increased in a glucose concentrationdependentmanner，with peak levels of VEGFmRNA，MMP-2mRNA and the protein ofMMP-2 at30mmol/L glucose and peak level of VEGF protein at40 mmol/L glucose.Under the same intervention，the expression of VEGF and MMP-2 was higher after intervening for 48 hours than 24 hours（P＜0.05）.ConclusionHigh glucose can promote the proliferation of A549 cells，strengthening the resistance to cisplatin and the expression of VEGF and MMP-2.

glucose；lung adenocarcinoma；growth；vascular endothelial growth factor；matrixmetalloproteinase-2

R 734.2

A

1000-1492（2016）03-0363-06

時間：2016/1/28 14：23：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.024.html

2016-01-08接收

安徽省自然科學基金面上項目（編號：1308085MH141）；

安徽醫科大學科研基金資助項目（編號：2010xkj115）

1安徽醫科大學第四附屬醫院呼吸內科，合肥 230022

2安徽病原生物學省級實驗室和人獸共患病安徽省重點實驗室、安徽醫科大學基礎醫學院病原生物學教研室，合肥230032

李曉峰，男，碩士研究生；

束 軍，男，醫學博士，碩士生導師，責任作者，E-mail：J. Shu@126.com