糖原合成激酶-3對肝硬化失代償患者脂多糖介導的過度炎癥反應的影響

范聲春，徐 龍，羅盼

糖原合成激酶-3對肝硬化失代償患者脂多糖介導的過度炎癥反應的影響

范聲春，徐 龍，羅盼

目的探討糖原合成激酶-3（GSK-3）在脂多糖（LPS）誘導肝硬化患者外周血單核細胞（PBMCs）炎癥反應中的作用。方法將不同分期的肝硬化患者PBMCs分為對照組、LPS組、SB216763組、SB216763+LPS組，收集細胞培養上清液，采用ELISA法檢測上清液中腫瘤壞死因子α（TNF-α）與白細胞介素10（IL-10）的表達水平。結果所有研究對象中，LPS組TNF-α和IL-10含量明顯高于對照組（P＜0.01），SB216763+LPS組TNF-α和IL-10的含量較LPS組明顯降低（P＜0.01）。肝硬化失代償期并腹膜炎患者、LPS組的TNF-α含量顯著高于肝硬化代償期患者（P＜0.05），而IL-10的表達水平與代償期患者比較無明顯改變。在SB216763+ LPS組、肝硬化失代償期并腹膜炎患者TNF-α和IL-10的含量與肝硬化代償期患者無明顯差異。另外，TNF-α的表達水平隨Child-Pugh分級和MELD評分增加逐漸升高，而IL-10的表達水平卻無明顯變化。結論抑制GSK-3的活性可以減少TNF-α和IL-10的分泌，為肝硬化失代償期合并腹膜炎患者的治療提供了一個新思路。

糖原合成酶激酶-3；脂多糖；失代償期肝硬化

肝硬化失代償患者內毒素血癥發生率可達到46.5%～75.9%［1］，細菌產物如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）暴露在血液循環的早期，體內免疫細胞促炎因子分泌增多和抗炎因子分泌減少［2］。LPS通過激活單核/巨噬細胞與TLR4受體結合再激活核轉錄因子кB（nuclear transcription factors，NF-кB），NF-кB進而誘導多種炎癥因子的表達介導炎癥反應。糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）是廣泛存在于真核生物體內的絲/蘇氨酸激酶家族，參與細胞的生長、活化和凋亡。最近研究［3］顯示，GSK-3參與人類的炎性疾病，主導炎性因子的產生，對NF-кB的活性調節起到很重要的作用，在調節炎癥細胞因子和抗炎癥細胞因子之間的平衡中起關鍵作用。該研究旨在探討GSK-3活性在維持LPS誘導乙肝肝硬化失代償患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分泌促炎因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）和抗炎因子白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）平衡調節中的作用。

1 材料與方法

1.1 病例資料研究對象為南昌市第九醫院住院患者，肝硬化失代償期患者合并腹膜炎30例、肝硬化失代償期30例、肝硬化代償期患者15例，臨床資料見表1。乙型肝炎后肝硬化診斷參考《慢性乙肝防治指南（2010版）》，排外心、肺、腦、腎等器官實質性病變；腹膜炎診斷標準：①不同程度的發熱、寒戰、腹痛、腹部壓痛及反彈痛；②腹水中性多形核細胞數＞0.25×109/L；③腹水培養陽性/陰性；④腹水迅速增加、利尿效果不佳［4］。CTP評分依據Child-Turcotte-pugh分級，A級5～6分，B級7～9分，C級＞9分，MELD評分即終末期肝病評分，MELD=9.6×In［肌酐（mg/dl）］+3.8×In［膽紅素（mg/dl）］+11.2×In（INR）+6.4×病因：膽汁淤積性和酒精性肝硬化為0，其他病因為1。

1.2 試劑胎牛血清、RPMI-1640培養基購自美國Hyclone公司；人TNF-α、人IL-10 ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；GSK3抑制劑SB216763購自美國Selleck公司；LPS購自美國Sigma公司。

1.3 方法用無菌無熱原抗凝試管采集研究對象新鮮外周靜脈血2 ml，立即在實驗室超凈臺內采用淋巴細胞分離液（Ficoll分層液、密度1.077±0.01）運用密度梯度離心法（1 500 r/min，30 min）分離提取出PBMCs，對每一份標本新鮮分離出來PBMCs用PBS洗滌2次后，立即進行細胞計數及臺盼藍染色法計算細胞活力，對細胞計數及活力符合要求的樣本PBMCs移入2 ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，細胞密度調整為5×105/ml。將2 ml含PBMCs的細胞混懸液均分成為對照組、LPS組（單予LPS刺激）、SB216763（GSK3抑制劑）組（單予SB216763處理）、SB216763+LPS組（先予SB216763處理后予LPS刺激），每組細胞懸液0.5 ml，分別將4組細胞懸液移入24孔板內。對照組孔內不加任何刺激物；LPS組加入終濃度為1μg/ml的LPS；SB216763組加入終濃度為10μmol/L SB216763；SB216763+LPS組加入終濃度為10 umol/l SB216763預先處理1 h后再加入終濃度為1 μg/ml的LPS刺激20 h。各組組刺激結束后收集細胞懸液移入離心管低速離心（1 000 r/min，10 min）后吸取上清液分裝入EP管內，放置-20℃冰箱備檢。細胞因子TNF-α、IL-10的定量測定采用ELISA試劑盒（雙抗體夾心法）。取出細胞培養上清液、TNF-α、IL-10 ELISA試劑盒放置室溫平衡，然后按操作步驟酶標儀測定細胞因子水平。

1.4 統計學處理采用SPSS 19.0統計分析軟件，數據以-x±s表示，多組間均數的比較采用方差分析，兩組間的比較采用LSD法（多組間方差齊）和Dunnett T3法（多組間方差不齊）進行。

2 結果

2.1 研究對象PBMCs分泌TNF-α的比較與肝硬化代償期患者比較，肝硬化失代償期患者無明顯變化，而失代償肝硬化并腹膜炎患者LPS組TNF-α分泌量明顯增加，LPS刺激組F=15.93，SB216763 +LPS組F=6.15，（P＜0.01），提示失代償肝硬化并腹膜炎患者促炎因子TNF-α隨著病情加重分泌持續增加。LPS組TNF-α含量明顯高于對照組和SB216763組（P＜0.01）；與LPS組比較，SB216763 +LPS組TNF-α含量明顯下降（P＜0.01）。提示抑制GSK的活性可以明顯減少TNF-α的分泌。見表2。

2.2 研究對象PBMCs分泌IL-10的比較各研究對象PBMCs，與肝硬化代償期患者比較，肝硬化失代償期和肝硬化失代償期并腹膜炎患者LPS組IL-10含量無明顯差異，提示失代償期抗炎因子IL-10無明顯升高。與對照組比較，LPS組IL-10含量明顯升高，LPS刺激組F=10.22（P＜0.01）；與LPS組比較，SB216763+LPS組IL-10含量明顯下降，SB216763+LPS組F=6.04（P＜0.01），提示抑制GSK的活性可以明顯減少IL-10的分泌。見表3。

2.3 肝硬化失代償患者中Child-Pugh分級對TNF-α、IL-10分泌的影響在肝硬化失代償患者中Child-Pugh分級A、B、C級TNF-α的表達水平差異有統計學意義（F=4.75，P=0.017）。與A級比較，B級C級TNF-α的表達水平顯著升高（t=2.32、3.14、P＜0.01）。在肝硬化患者中Child-Pugh分級A、B、C級IL-10的表達水平差異有統計學意義（F =5.46，P=0.01）。與A級比較，C級IL-10的表達水平顯著降低（t=3.135、P＜0.05）。結果顯示，隨著病情進展，TNF-α的分泌逐漸增加，IL-10分泌無明顯變化，提示抗炎和促炎因子之間已經出現失衡。見表4。

2.4 在肝硬化失代償患者中MELD評分對TNF-α、IL-10分泌的影響在肝硬化失代償患者中MELD評分＜9、9～19、19～29分的TNF-α含量比較，F=6.775，P=0.002，與A組比較，B組和C組TNF-α的含量明顯增多（P＜0.05），見表5。MELD評分＜9、9～19、19～29分的IL-10含量比較，F= 3.315，P=0.051，與A組比較，B組和C組IL-10含量明顯減少（P＜0.05），見表5。根據MELD評分患者的結果顯示，隨著評分的增加，TNF-α含量分泌逐漸增加，而抗炎因子IL-10的分泌卻無明顯變化，提示抗炎和促炎因子之間出現失衡。

3 討論

GSK-3β通路在調節炎癥細胞因子和抗炎癥細胞因子之間的平衡中起關鍵作用。本研究觀察了肝硬化代償期和失代償期患者外周血單核細胞GSK-3活性受抑制前后由LPS介導PBMCs分泌的TNF-α、IL-10表達水平的變化。GSK-3活性未抑制時，肝硬化代償期患者、肝硬化失代償期患者和失代償合并腹膜炎患者3組不同的人群中，LPS均可以誘導外周血單核細胞促炎因子（TNF-α）和抗炎因子（IL-10）的分泌增加。與肝硬化代償期患者組比較，肝硬化失代償期合并腹膜炎組TNF-α含量明顯升高，IL-10含量無變化，提示促炎細胞因子（TNF-α）過多的表達和抗炎因子（IL-10）的表達不足的特點是LPS刺激肝硬化免疫細胞的主要免疫反應特征，即肝硬化終末期患者合并感染的炎癥反應表現。

為了觀察GSK-3β活性對乙肝肝硬化患者外周血單核細胞LPS介導炎癥反應的影響，實驗中設置GSK3β特異性抑制劑SB216763和SB216763+LPS組，當預先給予SB216763處理后再予LPS刺激時細胞因子的表達發生明顯變化，與LPS組比較，SB216763+LPS組即GSK-3活性受抑制后促炎因子TNF-α和抗炎因子IL-10表達均較受抑制前明顯下降。GSK-3抑制劑通過抑制其活性從而阻斷了由LPS誘導TLR4介導的信號通路（GSK-3是該信號通路的關鍵節點），因而信號無法向細胞核內傳遞從而減少TNF-αmRNA和IL-10 mRNA基因表達來調節其表達水平，結果證實GSK-3的活性調控著促炎因子和抗炎因子的平衡，從而決定了肝硬化失代償期患者炎癥反應的轉歸，小鼠動物實驗亦有類似結果［5］。

有文獻［6］報道GSK-3可以激活NF-кB，NF-кB進入核內誘導多種炎癥因子的表達，包括TNF-α、IL-2、IL-1、IL-6、IFN-β等，其中TNF-α作用最為重要。促炎因子TNF-α過量表達而抗炎因子IL-10表達不足，這種趨勢在肝硬化失代償合并腹膜炎患者的PBMC中表現更加明顯［7］，本實驗結果表明，隨著病情加重TNF-α分泌持續增加，而IL-10的分泌卻無明顯變化。TNF-α等炎癥因子本身對組織細胞具有損傷作用［8］，同時還誘導免疫細胞產生其他炎癥細胞因子及進一步刺激PBMCs產生TNF-α等促炎因子，引起級聯放大效應，過量促炎細胞因子釋放入血液循環產生一系列難以控制的全身瀑布式炎癥反應［9］，最終導致組織器官嚴重損傷。GSK-3活性被其抑制劑SB216763抑制后由LPS介導的細胞信號轉導通路被阻斷，NF-кB活性不能被激活，繼而導致由NF-кB誘導的炎癥細胞因子的產生減少［10-11］，此時IL-10也能抑制由LPS介導的PBMCs產生的促炎細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6，同時可直接抑制PBMCs的活性。本實驗結果顯示肝硬化患者TNF-α的表達水平隨Child-Pugh分級和MELD評分增加逐漸升高，而IL-10的表達水平卻無明顯變化。對合并和未合并腹膜炎的肝硬化失代償患者進行了跟蹤隨訪，發現合并感染的30例患者中有8例放棄治療感染惡化而死亡。這從臨床上驗證了肝硬化失代償期患者合并感染后易導致失控性炎癥反應，如不及時有效的控制將導致患者病情惡化。

本文探討了GSK-3在LPS誘導肝硬化患者PBMCs炎癥反應中的作用，既往相關報道多是以動物為實驗對象，而本研究選取了3種不同分期的肝硬化患者PBMCs為實驗對象，較動物實驗更具臨床意義。在體外實驗LPS刺激肝硬化失代償期患者PBMCs的特征反應是促炎因子過度表達和抗炎因子表達不足，特別是在并發腹膜炎的情況下，這種特征更加明顯。其機制可能與GSK-3磷酸化缺陷而活性增強有關，導致促炎因子過度分泌從而產生全身難以控制的瀑布式炎癥反應。體外應用GSK3抑制劑可以明顯減少促炎因子TNF-α的產生，該作用在體內環境下和體外是否相同，需要體內實驗進一步證實，本研究為肝硬化失代償期患者并發或潛在感染的治療提供了一個新的啟發，進一步的機制還有待研究［12］。

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Effects of glycogen synthase kinase-3 on lipopolysaccharide induced excessive inflammatory response in patients w ith decom pensated cirrhosis

Fan Shengchun，Xu Long，Luo Pan
（The Ninth Hospital of Nanchang Infectious Disease Hospital of Nanchang University，Nanchang 330002）

ObjectiveTo investigate the effect of Glycogen synthase kinase-3（GSK-3）on inflammatory response mediated by LPS in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）of patientswith decompensated cirrhosis.MethodsPBMCs of different liver cirrhosis period patients were divided into control group，LPS group，SB216763 group and SB216763+LPS group.ELISA was used tomeasure the levels of TNF-αand IL-10 in the culture supernatant of PBMCs.ResultsThe levels of TNF-αand IL-10 in the LPSgroup were significantly higher than those of the control group（P＜0.01）.Compared with LPSgroup，SB216763+LPSgroup decreased the levels of TNF-αand IL-10 obviously in all research objects（P＜0.01）.Compared with the liver cirrhosis compensatory period patients（15），the level of TNF-αincreased obviously（P＜0.05），while the IL-10 level had no significant change in the LPSgroup of liver cirrhosis decompensated period combined with peritonitis patients（30）.The level of TNF-αand IL-10 had no obvious difference in the SB216763+LPSgroup of the two research objects.With Child-Pugh classification and MELD score increasing，the TNF-αlevel obviously raised，while the IL-10 level had no obvious change.ConclusionInhibiting the activity of GSK-3 could reduce the secretion of TNF-αand IL-10.This provides a new idea for the treatment of liver cirrhosis decompensated period combined with peritonitis patients.

GSK3；lipopolysaccharide；decompensated liver cirrhosis

R 575.2

A

1000-1492（2016）03-0406-04

時間：2016/1/28 14：23：11 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.042.html

2015-12-08接收

國家自然科學基金（編號：81160065）

南昌大學附屬感染病醫院（南昌市第九醫院）慢性肝病科，南昌 330002

范聲春，男，碩士，主治醫師；徐 龍，男，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：xulong791@126.com