家蠶微孢子蟲診斷方法研究進展

曹琛福， 林彥星， 呂建強， 花群義

(深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東深圳 518045)

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家蠶微孢子蟲診斷方法研究進展

曹琛福， 林彥星， 呂建強， 花群義

(深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東深圳 518045)

摘要自家蠶微粒子病被發現近200a來，它給世界各養蠶國家造成巨大的經濟損失，已被列為蠶種生產的唯一檢疫對象。為了更好地了解并總結家蠶微孢子蟲現有的診斷方法及其研究進展，該研究主要對近些年來在光學顯微鏡檢測、電鏡觀察檢測、免疫學檢測和分子生物學檢測方面的研究進行了綜述，并且展望未來發展趨勢，以期對家蠶微粒子病進行更快速、準確的診斷與防治。

關鍵詞家蠶微孢子蟲；診斷；方法

家蠶微粒子病是由微孢子蟲(Microsporidia)寄生而引起的一類蠶的傳染性原蟲病。微孢子蟲是專性細胞內寄生的真核生物，廣泛寄生于昆蟲等無脊椎動物及哺乳類、鳥類、魚類等脊椎動物體內，至今已被發現的微孢子蟲達150屬、1 200種以上[1]。家蠶微孢子蟲(Noesmabombycis)屬于真菌界微孢子蟲門微孢子蟲綱微孢子蟲目。1857年Nageli首次從病蠶中鑒定出家蠶微孢子蟲[2]，由于它既可以食下傳染又可以胚胎傳染，對蠶業養殖造成致命的損害。1845年，法國Vaucluse洲首次暴發家蠶微粒子病，隨后迅速蔓延到歐洲其他蠶區，給19世紀的歐洲養蠶業帶來毀滅性打擊，后來微粒子病又傳播到日本和中國等亞洲國家，給這些國家的養蠶業造成巨大的經濟損失。世界各養蠶國家和地區都將其列為蠶種生產的唯一檢疫對象，也成為蠶業界研究的重點和難點。

1986年我國農牧漁業部動物檢疫所將家蠶微粒子病列入《動物檢疫》目錄，之后相繼發布農業行業標準《桑蠶一代雜交種檢驗規程》(NY/T327-1997)、《桑蠶原種檢驗規程》(GB19178-2003) 和國家標準《桑蠶原種》(GB19179-2003)，2014年又發布出入境檢驗檢疫行業標準《家蠶微粒子病檢疫技術規范》(SN/T 4292-2015)。這些標準對家蠶微粒子病的檢驗檢疫進行了規范。筆者對家蠶微粒子病病原的主要檢測技術、診斷方法和最新的研究進展進行綜述。

1光學顯微鏡檢測家蠶微孢子蟲

自Louis Pasteur創立母蛾鏡檢法100多年以來，在蠶業生產實踐中一直沿用普通光學顯微鏡鏡檢法(母蛾鏡檢法)來診斷家蠶微孢子蟲，但其存在很多不足。首先，該方法只能以中間產品母蛾作為檢驗對象；其次，該方法需依賴有經驗人員實施檢驗，易與母蛾樣本中的綠僵孢子、曲霉孢子、花粉粒等混淆。在實施鏡檢時，常用的染色方法有姬姆氏染色、革蘭氏染色。在此基礎上，研究人員采用多種特殊染色法來鑒定微孢子蟲。唐順明等[3]應用高錳酸鉀-甲基紫法將家蠶微孢子蟲染成紫色，而綠僵孢子、曲霉孢子則呈紫褐色，花粉粒呈淡黃色塊狀，從而能快速地鑒別家蠶微孢子蟲和其他干擾物。Ignatius等[4]采用抗酸的三色染色法將微孢子蟲染成粉紅色，從而將真菌、細菌及糞樣區別開來。牛安歐等[5]采用韋伯氏Chromotrop染色法將比氏腸微孢子蟲、腸腦炎微孢子蟲、海倫腦炎微孢子蟲及兔腦炎微孢子蟲等染成紅色，而細菌和糞渣等染成綠色。劉吉平等[6]用Calcofluor M2R染色法染色后，在熒光顯微鏡下可見家蠶微孢子蟲發出強烈的青藍色熒光，病毒多角體和細菌不被染色，真菌孢子染色后的熒光相對較弱，可有效地對形狀相似物進行鑒別。采用多種染色法鏡檢，可提高檢測的敏感性。雖然采用這些方法可以很好地與其他孢子及雜物相區分，但染色法不能鑒別孢子蟲的具體種屬[7]，對微孢子蟲種屬特異性的鑒別仍需借助電子顯微鏡、現代免疫學和分子生物學的技術和手段[8]。

2電子顯微鏡檢測家蠶微孢子蟲

成熟微孢子蟲主要由孢子壁(Sporewall)、孢原質(Sporoplasm)、發芽裝置(Extrusion apparatus)和孢子細胞器(Organelle)等組成[9]。孢子壁厚而堅硬，由3層結構組成，由外入內依次為刺突狀外層孢子外壁(Exospore)、透明薄層孢子內壁(Endospore)和纖維性內層的原生質膜(Plasmamembrane)[10-11]。孢子外壁由致密的淀粉纖維狀的蛋白質基質組成；孢子內壁由殼多糖和蛋白質組成，厚而均一，分別與孢子外壁和孢原質膜相連；原生質膜則將孢子壁與內部的孢原質隔開。孢原質的前部是由平滑的薄膜層疊成的極膜層，孢原質的后部有沿孢子短軸方向稍伸長的孢子。發芽裝置主要由孢子壁內側螺旋狀盤繞的極管、若干疊成片狀的薄膜層、結構相對松散的極膜層和由多層膜包圍成的后極泡構成，極膜層可分為緊密和疏松兩個形態不同的前后部分。孢子細胞器主要由內質網(Endoplastic reticulum)、極膜層結構(Polaroplast)、高爾基體(Golgiosome)和高度簡化的線體(Mitosome)等組成[12]。家蠶微孢子蟲的成熟孢子大小為(3.6~3.8)μm×(2.0~2.3)μm，呈卵圓形，表面光滑且折光性較強。家蠶微孢子蟲的極管前端與孢子縱軸呈平行狀，后端沿孢子壁與縱軸形成螺旋狀卷曲。它在感染的過程中存在2種形態的感染體即長極絲孢子和短極絲孢子，其中長極絲孢子的極管圈數一般為12~14圈，13圈居多，極絲傾斜角一般為52°[13]。

3免疫學方法檢測家蠶微孢子蟲

3.1微孢子蟲蛋白質組學采用一維和二維蛋白電泳技術對微孢子蟲的蛋白成分、蛋白組成進行分析，同時對微孢子蟲進行識別、分類和鑒定。1982年Streett等[14]利用SDS-PAGE技術區分家蠶微孢子蟲和變形微孢子蟲。1989年梅玲玲等[15]從蛋白質氨基酸組成上發現家蠶微孢子蟲和桑尺蠖來源的微孢子蟲基本相同。1999年高永珍[16]通過電泳圖譜發現家蠶微孢子蟲的谷氨酸、賴氨酸和天冬氨酸含量要比其他微孢子蟲高。2004年黃少康等[17]利用雙向電泳技術發現家蠶微孢子蟲和內網蟲屬樣微孢子蟲的蛋白點差異明顯。黨曉群等[18]利用質譜技術及序列分析發現微孢子蟲的亮氨酰氨肽酶和絲氨酸蛋白酶在兔腦炎微孢子蟲、蝗蟲微孢子蟲、蜜蜂微孢子蟲、腸道微孢子蟲和比氏腸道微孢子蟲中的相似度較高，其進化較保守。

微孢子蟲孢壁蛋白的成分和特性可被應用于微孢子蟲的分類和檢測上。趙唯希[19]鑒定了家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP5、SWP8、SWP12、SWP26、SWP30、EOB14207.1，認為它們可能成為微孢子蟲檢測和抗微孢子蟲藥物設計的新靶標。河原煙勇等[20]比較了8種微孢子蟲的表面蛋白，證實它們可以作為微孢子蟲的分類依據，其中包括熱休克蛋白。Peyretaillade等[21]也獲得小孢子蟲和腦炎微孢子蟲的HSP70基因的“同系物”。極絲蛋白主要有PTP1、PTP2、PTP3，與孢子的侵染作用密切相關，這可能會給微孢子蟲的診斷和治療帶來新的發展空間[22]。高永珍[16]從家蠶微孢子蟲和藍螢葉甲微孢子蟲中抽提了極絲蛋白進行SDS-PAGE的比較，發現這2種孢子蟲孢子極絲蛋白的電泳圖譜基本相同，都含有多條蛋白帶，并且都有33 kD的主帶。

3.2家蠶微孢子蟲免疫學檢測檢測技術包括免疫測定法、間接免疫熒光法、酶聯免疫吸附試驗、對流免疫電泳和蛋白印跡分析等[23]。郭廣清[24]利用發芽液制備單克隆抗體來鑒定家蠶微孢子蟲，還針對家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP32制備單克隆抗體，結合免疫層析技術制備膠體金免疫試劑條，其檢測靈敏度達8.0×106個/mL。李艷紅等[25]通過制備家蠶微孢子蟲總蛋白多克隆抗體，建立免疫熒光檢測家蠶微孢子蟲的方法(IFA)。該方法具有快速、特異性強、靈敏度高、穩定性好、操作簡便等特點。萬淼[26]建立了雙抗體夾心ELISA檢測家蠶微孢子蟲的方法，對純化孢子的檢測最低量為 3.125×105個/mL，對“添毒”蠶卵的檢測最低量為 5.000×106個/mL。陳祖佩等[27]采用家蠶微粒子蟲致敏碳素凝集法檢測母蛾微孢子敏感性，發現它明顯高于顯微鏡檢測技術對家蠶微粒子蟲的檢測。萬嘉群[28]分別采用酶標抗體間接法和酶標抗體 PAP 法檢測家蠶微粒子蟲孢子。

4分子生物學檢測家蠶微孢子蟲

4.1家蠶微孢子蟲核酸分子雜交診斷技術韋亞東等[29]根據家蠶微孢子蟲的核糖體RNA基因高度保守的特點，采用原位雜交技術將標記的探針在組織和細胞水平鑒定目標核酸的存在，從而對家蠶卵和幼蟲體內感染的家蠶微孢子蟲進行早期診斷。然而，這些方法由于操作復雜、耗時和需要較高檔的儀器設備，很難在生產上大面積推廣和運用。邱寶利等[30]利用核酸點雜交和Southern雜交技術，用1對家蠶微孢子蟲特異性引物(上游引物：5′-AGTGAATGTAGGAGGAGTAGAAAGAGGC-3′，下游引物：3′-GCGCAACTCATAATGGTTCGTCCTGTTT- 5′)[31]成功地從蠶業生產中流行的10多種病原性微孢子蟲中鑒定出來。采用特異性探針與SSU rRNA序列進行原位雜交，也檢測出艾滋病病人感染的拜氏微孢子蟲[32]。

4.2家蠶微孢子蟲普通PCR檢測方法目前，采用PCR方法檢測家蠶微孢子蟲時，主要針對家蠶微孢子蟲小亞單位核糖體RNS基因來設計特異性引物。陳秀等[33]根據家蠶微孢子蟲和變形微孢蟲的SSU rRNA 基因序列分別設計2對特異性引物，對家蠶微孢子和其他家蠶病原性微孢子蟲進行 PCR 診斷。劉吉平等[34]根據家蠶微孢子蟲及其相近種屬微孢子蟲的SSU rRNA 保守區域設計了1對引物V1F/530R。該引物對純家蠶微孢子蟲孢子 DNA模板的檢測敏感度達到 3×104個/mL，對模擬感染家蠶微孢子蟲孢子的蠶蛾 DNA 模板的檢測敏感度高達 3×105個/mL，兩者均達到或超過目前生產上使用的顯微鏡檢測靈敏度。何永強等[35]也利用家蠶微孢子蟲小亞單位核糖體RNA基因鑒別、檢測家蠶微孢子蟲。Hatakeyama等[36]分別從感染家蠶微粒子病原蟲的蠶卵和家蠶中抽提基因組 DNA作為模板，用多引物 PCR擴增特異的 DNA 序列，驗證多引物 PCR 可以實際應用于同時感染幾種能導致家蠶微孢子病的微孢子蟲的早期檢測，對蠶卵微粒子病的診斷研究具有實用價值。

4.3家蠶微孢子蟲熒光定量PCR檢測方法實時熒光定量PCR技術在微孢子蟲核酸定量檢測中也有很多應用的實例[35,37-39]。 何永強等[40]以家蠶微孢子蟲SSU rRNA基因長度為66 bp的片段作為靶標，設計特異性引物和TaqMan探針，成功構建檢測家蠶微孢子蟲的實時熒光PCR方法，并且研制出診斷家蠶微孢子蟲的試劑盒。Bourgeois等[37]采用熒光定量PCR方法在樣本差異低的情況下對東方蜂微粒子蟲進行檢測和定量分析。Polley等[38]研發了一種僅使用SYBR Green實時PCR方法，實現對感染多種微孢子蟲的糞便樣品同時檢測和種屬鑒定，有17種陽性樣品通過熒光定量PCR檢測方法分析，其中14種感染比氏腸微孢子蟲、2種感染具褶孢蟲屬孢子蟲、1種感染兔腦炎微孢子蟲。上述分子生物學方法在靈敏度和特異性方面比傳統的顯微鏡檢法有很大的優勢。

4.4家蠶微孢子蟲環介導等溫擴增技術(LAMP)檢測技術LAMP是近年來建立的一種新的核酸擴增技術，具有特異性強、靈敏度高、快速簡便且成本低廉等優點。燕薇[41]運用LAMP法檢測家蠶微孢子蟲，最低檢測極限為10個孢子/mL，可有效區分感染家蠶的主要致病細菌(靈菌、蘇云金桿菌)和真菌(白僵菌、綠僵菌、曲霉)。對感染微粒子病的家蠶進行早期診斷時，應用LAMP技術比常規的顯微鏡檢查提早24 h左右。

目前，在診斷家蠶微孢子蟲時，除了選擇家蠶微孢子蟲的蛋白或核酸作為靶標，也有學者嘗試通過比較感染微孢子蟲的家蠶(卵)與未感染微孢子蟲家蠶(卵)的差異蛋白為檢測靶標。龔娟娟[42]發現，家蠶低分子量Lip 30 kD蛋白在感染了微孢子蟲的蠶卵中的表達量比未感染蠶卵中的表達量高3倍。

5展望

對家蠶微孢子蟲的診斷方法的研究主要包括光學鏡檢、電鏡檢查、免疫學技術、分子生物學技術等。光學鏡檢是較古老且經典的檢測方法，但是一般需要在感染晚期才能觀察到，對防治起不了太大的作用。電鏡檢查必須經過超薄切片、電鏡觀察，對設備和操作人員的技術要求較高，目前主要用于科研。免疫學的方法多數是用家蠶微孢子蟲蛋白進行免疫獲取相應的多克隆抗體或單克隆抗體，其準確性較高，靈敏性也好，但由于對其結構蛋白研究不夠深入，在鑒別各屬微孢子蟲時較為困難。分子生物學技術憑借其特異、靈敏、操作簡便等優勢，近年在鑒別家蠶微孢子蟲方面研究比較活躍，但其檢測也需要在實驗室條件下才能完成。總之，這些方法雖然有各自的優點，但都存在一定的缺陷，很難在基層生產上推廣。因此，研究人員需要更多地發掘家蠶微孢子蟲特異性結構蛋白，結合單克隆抗體技術研制出諸如膠體金試劑條等既快速、簡便、高效又能夠在基層廣泛使用的檢測方法，或利用分子生物學技術研制適合現場的快速、靈敏、準確的方法。

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Research Progress of Diagnosis ofNoesmabombycis

CAO Chen-fu, LIN Yan-xing, LV Jian-qiang et al (Animal & Plant Inspection and Quarantine Technology Centre, Shenzhen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen, Guangdong 518045)

AbstractSince the discovery of pebrine disease nearly two hundred years ago, pebrine disease has caused serious damage to the world’s sericulture country.It is the only quarantine object of the silkworm eggs in the sericulture countries and regions.In order to better understand and summarize the diagnostic method ofNoesmabombycisand its research progress, we reviewed the researches on optical microscopic microscopy detection, electron microscope inspection, immunology and molecular biology detection in recent years.The future development was forecasted in order to rapidly and accurately control and diagnose theNoesmabombycis.

Key wordsNoesmabombycis; Diagnosis;Method

收稿日期2015-12-16

作者簡介曹琛福(1977- )，男，江西南康人，高級獸醫師，博士，從事動物及其產品的檢驗檢疫工作。

基金項目國家質檢總局科研項目(2013IK042)。

中圖分類號S 884.2+1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)02-001-03