秀麗隱桿線蟲在抗衰老領域應用的研究進展

游牧 胡云虎

[摘要]秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是抗衰老研究中重要的模式生物之一，被廣泛應用于抗衰老物質的篩選和抗衰老分子機制的研究中。本文回顧了近年來秀麗隱桿線蟲在抗衰老領域應用的研究進展，介紹了抗衰老物質的篩選情況，系統綜述了作為抗衰老物質篩選評價的生理指標和反映抗衰老機制的生化指標包括壽命、生存率、生存時間、ROS含量、脂褐質積累以及daf-16，sod-3，gst-4，hsps基因調控情況等，指出了研究中存在的問題，展望了秀麗隱桿線蟲在抗衰老研究中的應用前景。

[關鍵詞]抗衰老；秀麗隱桿線蟲；生理指標；生化指標

[中圖分類號]R339.3+8

[文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）02-0104-04

衰老是生物體必然的生理趨勢，是一種復雜多變的過程，它和老年病的發生密切相關。延緩衰老可以減少老年病的發生，如動脈粥樣硬化、冠心病等，具有重要意義。抗衰老研究往往受困于實驗對象選擇困難、實驗周期過長、樣本數有限等問題，也影響抗衰老研究在分子領域的突破。秀麗隱桿線蟲（下文簡稱“秀麗線蟲”）是一種非寄生性低等無脊椎生物，因其發育周期明確、時間短；品系資源充足，信息交流便利；易于大規模培養進行大樣本量實驗消除個體差異；信號通路高度保守等優勢被廣泛應用于抗衰老藥物篩選、環境毒理學等領域的研究。本文綜述了以秀麗線蟲為動物模型的抗衰老研究現狀，為開展相關研究工作提供參考。

1 生理指標

1.1 自然壽命

自然壽命是進行抗衰老研究分析的首選指標。秀麗線蟲壽命實驗通常采取同步化培養的L4期線蟲，放置在涂有實驗藥物的NGM培養基上，鋪板第1天記錄為第0天壽命，此后每天顯微鏡鏡檢記錄線蟲的死亡數和存活數。藥物中可以添加FUDR抑制線蟲產卵，也可以每天更換NGM培養基。20世紀80年代開始使用秀麗線蟲篩選抗衰老藥物，很多物質如維生素E、黃酮、銀杏提取物、白藜蘆醇等效果明顯。近年研究結果顯示，大量人工合成物質或者天然植物提取物也有明顯的抗衰老作用。Asthana等研究顯示，5μM、25μM和50μM黃金樹苷處理均能夠延長生命周期，其中25μM效果最為明顯，可以延長15.47%。鄭善清等使用含有5μM、10μM、50μM、500μM和2000μM綠原酸的培養基處理，多次獨立的實驗結果表明自然壽命平均能夠延長21.3%，50μM處理組效果最佳，平均壽命延長25.2%。王麗萍等利用自主設計合成的抗壞血酸過氧化物酶的新型模擬酶（DhHP-6）給藥處理后發現，野生型線蟲平均壽命從（16.2±0.53）d提高到（19.7±0.26）d，提高21%。Kim J等報道顯示0.5nmM納米鉑處理后野生型線蟲平均壽命延長了22.3%、姜黃素、4羥基E環烯醚萜葡萄糖甙（4HEG）、側柏種子正丁醇提取物（BSPO）、4對羥基苯甲酸（4HBA）、奎尼酸、阿司匹林、葡萄籽原花青素、墨角藻黃素、齊墩果酸、淫羊藿類物質、酪醇（特級初榨橄欖油提取物）、植物適應原（刺五加和紅景天的提取物）等也都有類似報道，延長范圍一般在15%-25%。文獻報道也有一些物質延長的程度更為明顯，比如Detienne等利用1.6μg/ml蜂皇乳處理可以使線蟲壽命延長33.9%； Vayndorf等研究發現lOmg/ml全蘋果提取物可以延長39.6%，最長生存天數提高25%。Zhang等研究發現使用160mg/L濃度MDHB處理后，線蟲壽命可以延長40%。壽命實驗多使用野生型品系，但也有研究使用fer-15（b26）等其他品系。另外，還有一些物質雖然不能延長正常狀態下的線蟲壽命，但是在脅迫狀態下可以明顯延長秀麗線蟲的生命周期，如兒茶素（EGCG），茶氨酸，玉米活性提取物四肽、紅藻活性物等。

1.2 抗性指標

生命周期的延長通常與機體對外界的抗脅迫能力有關，因此脅迫狀態下的生存時間、存活率和ROS產生量都是考察的重要指標。常見的脅迫環境主要有：熱脅迫、氧化應激脅迫、細菌感染、uv照射。熱脅迫一般在幼蟲期就進行藥物暴露，發育為成蟲后進行熱激，熱激溫度通常為35℃，熱激時間lOh左右。已有研究顯示，200μg/ml葡萄籽原花青素處理組線蟲平均生存時間為19. 6h，顯著延長了27.3%：0.1μg/ml EGCG處理后線蟲生存率提高13.1%：Asthana等將線蟲熱激37℃，4h后發現黃金樹苷處理組生存率提高了23.89%。

活性氧（ROS）是機體的正常代謝中間產物，ROS過多會造成機體內氧化系統與抗氧化系統的失衡，導致生物大分子的氧化損傷，引起氧化應激的發生，誘導疾病產生，加速衰老。氧化應激實驗中通常使用的強氧化劑主要是胡桃醌或百草枯，兩者均能迅速使機體產生大量ROS，抗衰老物質大都可以明顯清除ROS，提高機體抗氧化損傷能力。Liao等使用250μM胡桃醌刺激，姜黃素處理組ROS含量明顯下降。Liu等報道BSPO處理組，在500μM胡桃醌脅迫下有效降低了蟲體內ROS含量。Zhang等利用5mM百草枯進行氧化應激脅迫，在脅迫條件下齊墩果酸暴露組ROS水平顯著降低。Shukla等使用lOmM百草枯進行氧化脅迫刺激，20μM4HEG處理組的ROS產生減少43%，明顯改善線蟲體內ROS的積累。相似的結果還出現在EGCG，喹啉類藥物，MDHB等物質的研究中。胞內ROS水平目前主要使用分子探針CMH2DCFDA活體檢測，可避免研磨組織對ROS檢測造成的干擾。氧化應激實驗中比較常見的實驗對象是野生型，也有研究選用mev-l缺失品系，原因是由于該品系對過氧化物更加敏感，體內氧化自由基增加幅度更大。

細菌脅迫通常使用銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌，Vavndorf等用銅綠假單胞菌PA14感染秀麗線蟲，每8-13h檢查存活的蟲體，結果顯示對照組平均存活時間為（82±2.6）h，2.5mg/ml，5mg/ml和lOmg/ml處理組分別為（100±3.8）h， （111±4.4）h和（102±4.4）h，改善效果明顯。

uv脅迫是將線蟲暴露在紫外線下照射，張健煒等使用L4期線蟲，紫外強度為2000J/㎡，50mg/L紅茶水提取物處理后可以使線蟲的平均存活時間延長20.5%； Wiegant等使用紫外強度為IOOOJ/㎡，結果顯示紫外線暴露后線蟲的平均壽命由14.6d降低到9.6d，植物適應原處理組降低到11.ld，起到明顯的保護作用。此外還有學者制造高糖環境脅迫。目前研究認為抗衰老物質延緩線蟲衰老的效果可能是通過改善應激條件下的生存狀態，抗衰老物質的效用與其在各種脅迫狀態下的保護作用密切相關。

1.3 健康壽命

秀麗線蟲中健康壽命指標主要有體長、運動能力（爬行、咽泵、排便）等，脂褐質是近年來出現的健康壽命的新指標。脂褐質又被稱為“年齡斑塊”，是一種內源性自發熒光物質，主要沉積于神經、心肌、肝臟組織衰老細胞中，是溶酶體消解后的剩余物質形成的殘余體。在線蟲中，脂褐質只分布在腸道附近，可以通過檢查其自發熒光強度來觀測。Kim DK等使用40μM 4-HBA處理后，脂褐質積累減少了83.3%； Kim J等研究發現，不同濃度的納米鉑暴露lOd后，0.5mM納米鉑處理組脂褐質積累情況得到有效改善。全蘋果提取物、BSPO、中藥虎杖提取物等也都具有明顯降低脂褐質積累的功效。

2 生化指標

2.1 DAF-16蛋白核質轉運

對抗衰老物質的研究除了觀察對秀麗線蟲生理指標的改善，更多的是分析抗衰老物質的分子調控機制。由于秀麗線蟲基因的保守性和同源性，使其具有無可比擬的優勢。2008年度諾貝爾化學獎得主Chalfie M[30]以秀麗線蟲為實驗材料證明了綠色熒光蛋白（GFP）作為發光遺傳標記的價值。目前全球線蟲資源庫中有大量攜帶GFP的轉基因品系，使得對分子機理的研究更為便利和直觀。目前已知daf-16基因是哺乳動物FOXO基因的同源基因，是胰島素途徑下游的核心轉錄因子。正常生理狀態下，一系列磷酸化反應使DAF-16蛋白分散在細胞質中。當機體遇到脅迫時，DAF-16蛋白磷酸化水平降低，遷移入核發生核質轉運，活化大量抗脅迫基因。該實驗常用TJ356（DAF-16∷GFP）品系，對照組在熒光顯微鏡下通體綠色，發生核質轉運后，DAF-16蛋白聚集，蟲體出現大量綠色耀眼斑塊。Zhang等研究發現，齊墩果酸處理組核質轉運比率由6.5%提高到34.8%。Shukla等研究發現20μM 4HEG處理4h后核質轉運比率提高到45%。次血紅素六肽、酪醇等物質均可以調控DAF-16蛋白核質轉運的發生，激活下游抗衰老基因的轉錄，達到對線蟲抗衰老的調控。

2.2 抗氧化酶基因表達

抗氧化酶是維持機體氧化還原平衡的一類酶。機體內一旦形成過氧化物，它們可以把過氧化物轉換為毒害較低的物質，進行氧化防御。在報道中比較常見的指標主要是：SOD-3，GST4/7，GSH等。Zhang等研究發現齊墩果酸處理組中SOD3基因表達量明顯增加，Asthana等利用CF1553（SO-3∷GFP），CL2166（GST-4∷GFP）品系在25μM黃金樹苷暴露72h后檢測發現SOD3和GST4的表達量有顯著增加；Shukla等挑選野生型成蟲在20μM 4-HEG充分暴露后利用QRTPCR技術檢測，SOD-3基因的表達量增加了1.4倍。有學者研究發現0.1mg/ml奎尼酸（QA）處理野生型后，其SOD-3的含量大大提升。進一步研究發現當使用daf-16缺失品系CF1038[daf-16（mu86）I]時，QA無法對SOD-3的含量產生影響，而daf-16； daf-2雙基因缺失品系中的結果也表現一致，推測藥物促進DAF-16蛋白入核，提高了其轉錄活性，促進了下游基因抗氧化酶基因表達，增加了SOD-3等的表達量，有助于清除ROS。DhHP-6、EGCG、4HBA、玉米四肽、紅藻活性物、阿司匹林等都有相似結論。

2.3 熱休克蛋白基因表達情況

熱休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）是一類結構和功能高度保守的蛋白質。HSP-16.2通常被認為是敏感的抗應激標志物，也是較常見的檢測指標。Shukla等使用CL2070[dvls70（HSP-16.2∷GFP）]品系經過4HEG處理后發現HSP-16.2的表達量增加了1.5倍。Liu等將秀麗線蟲先35℃熱激1h，再20℃恢復24h，熒光酶標儀檢測顯示100μg/ml BSPO處理組的HSP-16.2∷GFP表達量提高到122.O%。KimDK等處理使用轉基因品系HSP-16.2∷GFP，36℃熱激2h，20℃恢復4h，發現單純熱激沒有提高HSP-16.2的表達量，熱激后加入4-HBA表達量大大提高。但Zhang等發現正常情況下奎尼酸不能增加HSP-16.2的產生量，但是熱激后可以增加HSP-16.2的產生量。推測是由于HSP-16.2也是daf-16的下游基因，daf-16基因的活化也導致了HSP-16.2表達的增加。阿司匹林、紅藻活性物、玉米四肽，黃金樹苷、齊墩果酸等也有類似結果。但Wiegant等通過實驗分析認為植物適應原的加入沒有能夠促進HSP-16.2的合成，其合成量遠沒有熱激產生量多。張健煒等研究顯示紅茶提取物組HSP-16.2∷GFP基因表達水平較正常對照組下調31.7%，認為可能與內質網應激減少有關。

3 展望

目前應用秀麗線蟲對抗衰老物質的篩選和抗衰老機制的研究已取得了豐碩的成果，研究工作相對系統全而，大量的抗衰老物質和一些重要信號通路已得到揭示和闡明。但是還有很多細節不明確，很多觀點還停留在假說上，缺乏足夠的證據予以證實。今后的工作可以采用基因組技術，廣泛搜集基因位點，建立數據庫并進行比較。此外要避免生理指標對抗衰老評價的偏差，增加客觀性和真實性。