高效液相色譜-串聯質譜法測定地表水樣品中5種有機磷酸酯代謝物

李闖修，趙曉麗，高立紅，史亞利，譚偉強*，蔡亞岐*

(1.青島理工大學　環境與市政工程學院，山東　青島　266033；2.中國環境科學研究院　環境基準與

風險評估國家重點實驗室，北京　100012；3.中國科學院生態環境研究中心　環境化學與

生態毒理學國家重點實驗室，北京　100085)

?

高效液相色譜-串聯質譜法測定地表水樣品中5種有機磷酸酯代謝物

李闖修1，趙曉麗2，高立紅3，史亞利3，譚偉強1*，蔡亞岐3*

(1.青島理工大學環境與市政工程學院，山東青島266033；2.中國環境科學研究院環境基準與

風險評估國家重點實驗室，北京100012；3.中國科學院生態環境研究中心環境化學與

生態毒理學國家重點實驗室，北京100085)

摘要：將固相萃取(SPE)和高效液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)結合，建立了河水樣品中5種有機磷酸酯(OPEs)代謝物的分析方法。樣品過濾后，使用HLB固相萃取小柱進行富集凈化，采用6 mL甲醇洗脫后氮吹定容。以Luna Phenyl-Hexyl色譜柱為分離柱，甲醇和50 mmol·L-1乙酸銨水溶液為流動相梯度洗脫，在電噴霧負離子模式下，采用多反應監測模式(MRM)進行測定。優化條件下，儀器測定限(IDL)為0.002~1.15 μg·L-1，方法檢出限(MDL)為0.15~4.48 ng·L-1，實際水樣加標濃度為10 ng·L-1和50 ng·L-1時回收率分別為54.1%~83.6%和57.8%~102%，相對標準偏差(RSD)分別為5.3%~19.5%和2.8%~15.7%。考察了基質效應對5種化合物分析的影響，同時應用該方法對武漢7個湖水樣品進行分析，除DEHP外其它4種OPEs代謝物均有檢出。該方法具有良好的精密度和準確度，可用于有機磷酸酯代謝物的環境行為研究。

關鍵詞：有機磷酸酯代謝物；高效液相色譜-串聯質譜；河水；固相萃取

隨著多溴聯苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)等溴代阻燃劑在世界范圍內逐步被禁用，有機磷酸酯(Organophosphate esters，OPEs)阻燃劑成為其主要替代品。由于阻燃效果好、生產成本低等優點，OPEs阻燃劑的使用量逐年增加[1-2]。除了用作阻燃劑外，OPEs還常作為增塑劑應用于地板拋光、涂料、工程塑料、環氧樹脂和電子產品等領域[3-4]。在大多數情況下，添加到產品中的OPEs主要通過物理作用與材料結合，因此，有機磷酸酯易通過磨損和揮發作用釋放到環境中[5-6]。目前，有研究表明OPEs廣泛存在于水體、沉積物、室內空氣和灰塵等各種環境介質中，以及魚類和人體血液等生物介質中[7]，并且會對人體健康產生負面影響，如磷酸三氯乙酯(Tris-2-chloroethyl，TCEP)具有致癌性、高毒性和環境持久性，非氯代的OPEs如磷酸三正丁基酯(Tri-n-butyl phosphate，TnBP)在慢性暴露后表現出神經毒性[8-9]。OPEs進入人體后會迅速代謝生成二烷基和二苯基類磷酸酯等代謝產物，并且可通過尿液等途徑排出體外，例如在尿液中檢出了作為主要代謝物的磷酸二苯基酯(Diphenyl phosphate，DPhP)[10-11]。雖然二烷基和二苯基類磷酸酯在人體內也會進一步水解為單烷基和單苯基類磷酸酯，但尿液中多數單酯含量均低于相應的二烷基和二苯基類磷酸酯的含量[12]。

鑒于有機磷酸酯在環境、生物體和人體中較高程度的降解代謝及普遍性，準確分析環境樣品中有機磷酸酯代謝物對于深入研究OPEs的遷移轉化和生物富集等環境行為具有重要意義。目前，關于OPEs代謝物的分析方法研究較少，僅有少數采用氣相色譜-串聯質譜聯用(GC-MS/MS)以及液相色譜-串聯質譜聯用(LC-MS/MS)分析的報道[10-11,13-15]。雖然GC-MS/MS無明顯的基體效應，但由于有機磷酸酯代謝物的極性較大，分析前必須進行衍生，因此這類方法的應用較少[11,13]。而LC-MS/MS分析有機磷酸酯代謝物的方法僅處于研究階段，在實際環境樣品分析中的應用較少[10-11,14-15]，其萃取方法和色譜分離仍有待進一步優化。

本研究采用固相萃取為水樣前處理技術，經濃縮凈化后的樣品用LC-MS/MS方法進行分離檢測，建立了實際水樣中5種OPEs代謝物的分析方法，可以滿足OPEs代謝物的檢測要求。

1實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

液相色譜儀(UltiMate 3000，美國Thermo Fisher公司)和Chromeleon 6.70色譜工作站;Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl色譜柱(150 mm×2.0 mm，5 μm)和Acclaim 120(150 mm×2.1 mm，5 μm)色譜柱。API3200三重四極桿串聯質譜儀(美國AppliedBiosystems公司)：包括電噴霧離子源(ESI)和Analyst 1.4.1工作軟件；固相萃取小柱包括Waters Oasis HLB(6 mL，200 mg)、HypeSep Retain PEP(6 mL,200 mg)和Water Oasis WAX(6 mL,150 mg)，GF/C玻璃纖維濾膜(英國Whatman公司，1.2 μm)。 Votex渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

5種OPEs代謝物標準品：磷酸二苯基酯(DPhP)、磷酸二(1,3-二氯-2-丙基)酯(BDCPP)、磷酸二異丁基酯(DiBP)、磷酸二正丁基酯(DnBP)、磷酸二乙基己基酯(DEHP)以及全氘代同位素內標物BDCPP-d10、DPhP-d10(純度95%)均購自美國TRC公司。甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific公司)，乙酸銨(美國Alfa Aesar公司)，實驗所用超純水由Milli-Q純水儀(美國Millipore公司)制得。

OPEs代謝物單標儲備液(1 000 mg·L-1)用甲醇配制，5種OPEs的混標儲備液(10 mg·L-1)用甲醇稀釋單標儲備液配制。OPEs代謝物同位素內標(DPhP-d10，1 mg·L-1；BDCPP-d10，10 mg·L-1)采用甲醇配制。所有儲備液置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2色譜-質譜條件

色譜條件：Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl色譜柱(150 mm×2.0 mm，5 μm)，柱溫25 ℃。流動相為甲醇(A)-50 mmol/L乙酸銨水溶液(B)，梯度洗脫條件：0~1 min,50%~100% A；1~11 min，100%A；11~11.5 min，100%~50%A；11.5~20 min，保持50%A。流速：0.2 mL·min-1,進樣量：15 μL。

質譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，分析物在負離子掃描下以多反應監測(MRM)模式分析。采用針泵進樣，分別進行Q1和Q3掃描確定母離子和子離子，優化解簇電壓(DP)、入口電壓(EP)等參數(見表1)。在選定色譜條件下，接入檢測流動相后優化Gas1、Gas2和離子噴霧電壓等參數，使信號穩定，靈敏度最高。優化后的質譜條件：氣簾氣壓力0.07 MPa；碰撞氣壓力0.02 MPa；離子噴霧電壓-4 500 V；霧化溫度500 ℃；離子源Gas1：0.34 MPa，Gas2：0.34 MPa。

表1　質譜檢測條件

*quantitative ion

1.3樣品前處理

地表水樣品為采自武漢某地的湖水，樣品保存于500 mL玻璃瓶中。

采用1.2 μm的玻璃纖維濾膜過濾水樣后，準確量取200 mL，加入50 μL同位素內標(內標物DPhP-d10和BDCPP-d10的質量濃度分別為50 μg·L-1和500 μg·L-1)，樣品通過Oasis HLB固相萃取小柱(6 mL,200 mg)進行萃取凈化。上樣前依次用5 mL甲醇和5 mL超純水活化小柱，上樣流速為3 mL·min-1，上樣完成后用10 mL超純水淋洗HLB小柱，然后在負壓下抽干，最后用6 mL甲醇洗脫，洗脫液在40 ℃下氮吹濃縮至0.5 mL以下，再用初始比例流動相定容至1 mL，待測。

2結果與討論

2.1樣品前處理條件的優化

2.1.1固相萃取小柱的選擇采用純水加標回收實驗分別考察了HLB、PEP和WAX 3種固相萃取小柱的萃取效果，結果發現，PEP和WAX小柱對DiBP和DnBP的回收率較低(0~14.2%)，其中WAX小柱對這兩種化合物的加標回收率為0，而HLB小柱的萃取回收率在50.2%~85.8%之間，可以滿足微量分析的要求，因此本文采用HLB小柱對水樣進行萃取富集。

圖1　未分離的DiBP和DnBP色譜圖(100 μg·L-1)Fig.1　Chromatogram of inseparable DiBP and DnBP(100 μg·L-1)

2.1.2洗脫液的選擇采用HLB小柱進行萃取富集，分別采用6 mL甲醇和乙腈作洗脫液進行加標回收實驗。結果表明，采用甲醇作洗脫液時5種OPEs代謝物的回收率較高，為61%~113%；乙腈作洗脫液時的回收率為16.5%~200%，其中對DEHP的平均回收率較低(16.5%)，而對DiBP和DnBP的平均回收率較高(200%)。本研究采用內標法定量，由于DiBP和DnBP的內標物DPhP-d10回收率較低，造成DiBP和DnBP的相對回收率較高。因此，本文采用甲醇作為洗脫液。

2.2HPLC-MS/MS條件優化

在流動相為甲醇和50 mmol·L-1乙酸銨水溶液條件下，使用Acclaim 120型色譜柱不能將同分異構體DiBP和DnBP有效分離(如圖1所示)，通過優化梯度洗脫條件也無法得到改善。而選用Luna Phenyl-Hexyl色譜柱可以實現兩種同分異構體的分離，在該體系下，優化流動相梯度洗脫條件后得到DiBP和DnBP的色譜圖(見圖2)。因此，本文采用Luna Phenyl-Hexyl色譜柱對5種OPEs代謝物進行分離。

采用Luna Phenyl-Hexyl色譜柱對5種OPEs代謝物進行分離，在梯度洗脫條件下，以甲醇-50 mmol·L-1乙酸銨水溶液作流動相時，5種OPEs代謝物的靈敏度較高，峰形尖銳對稱，但DiBP，DnBP和DPhP的分離度小。實驗采用甲醇和1 mmol·L-1四丁基氫氧化銨+1 mmol·L-1乙酸水溶液作流動相進行對比，以離子對試劑作為緩沖鹽，增強目標化合物的保留能力，以期達到更好的分離效果。研究發現，甲醇和1 mmol·L-1四丁基氫氧化銨+1 mmol·L-1乙酸水溶液作為流動相時，以上3種OPEs代謝物的分離度仍未得到改善，而且離子對試劑對色譜柱傷害較大。因此，本文采用甲醇和50 mmol·L-1乙酸銨水溶液作為流動相進行梯度洗脫，5種OPEs代謝物標準溶液的色譜圖如圖2所示。

2.3線性范圍與檢出限

用初始流動相(50%甲醇水溶液)分別配制0.2，0.5，1.0，3.0，5.0，10，100，500，1 000 μg·L-1系列濃度的混合標準溶液(內標物DPhP-d10和BDCPP-d10的質量濃度分別為50 μg·L-1和500 μg·L-1)，在優化的色譜和質譜條件下，以內標法進行定量，得出分析方法的線性范圍和檢出限等參數(見表2)。結果表明，5種化合物在較寬的質量濃度范圍內具有良好的線性，儀器測定下限(IDL,S/N=3)為0.002~1.15 μg·L-1,儀器定量下限(LOQ，S/N=10)為0.005~2.92 μg·L-1。本方法采用水樣體積為200 mL，經過前處理后最終定容至1 mL進行測定，根據河水樣品中5種化合物的實際濃度，估算3倍信噪比(S/N=3)時OPEs代謝物對應的濃度，得到方法檢出限(MDL)為0.15~4.48 ng·L-1。

表2　OPEs代謝物的線性回歸方程及相關參數

2.4精密度與準確度

對去離子水(加標濃度為25，250 ng·L-1)和實際河水樣品(加標濃度為10，50 ng·L-1)進行加標回收實驗，按本方法對水樣進行處理，平行處理5份再測定，考察方法的精密度和回收率(見表3)。結果表明，本文建立的分析方法對5種OPEs代謝物的檢測有良好的精密度與準確度。另外，為考察基質效應的影響，實際水樣經前處理后，在平行樣洗脫液中加入50 μL同位素內標(內標物DPhP-d10和BDCPP-d10質量濃度分別為50 μg·L-1和500 μg·L-1)，再分別加入質量2 ng或10 ng的混標溶液，使實際水樣加標濃度為10 ng·L-1或50 ng·L-1，根據如下公式計算基質效應(Matrix effect，ME)：ME= [(Ase-Ab)/At]× 100%，Ase是加標后的實際水樣經SPE濃縮凈化處理后進樣所得峰面積，Ab是未加標的實際水樣經SPE濃縮凈化處理后進樣所得峰面積，At是標準溶液直接進樣所得峰面積。從表3可以看出，該方法對實際水樣中BDCPP和DEHP的測定存在一定的基質效應，但在兩個加標水平下，除DiBP的回收率較低(54.1%和57.8%)外，其他代謝物的回收率均在66.9%~102%之間，因此對于低濃度的環境樣品，該方法的分析結果可以滿足環境分析的要求。

表3　去離子水和河水中OPEs代謝物的加標回收率及基質效應(n=5)

* no detected

2.5實際水樣的測定

采用優化的前處理方法和HPLC-MS/MS檢測條件，對武漢7個湖水樣品進行分析。結果表明，除DEHP均未檢出外，其它4個代謝物均有不同程度的檢出，其中1#水樣中OPEs代謝物的檢出濃度最高，DiBP達到42.8 ng·L-1，說明這些OPEs的降解代謝產物在水環境中普遍存在。

表4武漢湖水樣品中OPEs代謝物的濃度

Table 4Concentration of OPEs metabolites in lake water samples of Wuhan

(ng·L-1)

Analyte1#2#3#4#5#6#7#DPhP1.442.533.312.15-*--BDCPP18.3------DiBP42.82.252.329.4817.52.616.15DnBP13.82.576.937.8515.13.406.75DEHP-------

* no detected；1-7# represent seven lake water samples of Wuhan,respectively

3結論

本文將固相萃取與LC-MS/MS技術聯用建立了環境水樣中5種OPEs代謝物的分析方法，該方法具有靈敏度高、重現性好和可同時分析多種OPEs代謝物等優點，可以滿足環境中OPEs代謝物檢測的需求，為進一步開展有機磷阻燃劑的遷移轉化等環境行為研究奠定基礎。應用該方法對武漢湖水樣品進行分析，在水體中檢出了部分OPEs代謝物。

參考文獻：

[1]Gao L H，Li W H，Shi Y L，Liu J M，Cai Y Q.Environ.Chem.(高立紅，厲文輝，史亞利，劉杰民，蔡亞岐.環境化學),2014,33(10)：1750-1761.

[2]He L X，Cao S X，Zeng X Y，Yu Z Q，Sheng G Y，Fu J M.J.Instrum.Anal.(何麗雄，曹曙霞，曾祥英，于志強，盛國英，傅家謨.分析測試學報)，2013,32(4)：437-441.

[3]van der Veen I,de Boer J.Chemosphere,2012,88(10):1119-1153.

[4]Brandsma S,de Boer J,Leonards P E G,Cofino W,Covaci A.Trac-TrendsAnal.Chem.,2013,43:217-228.

[5]Marklund A,Andersson B,Haqlund P.Chemosphere,2003,53(9):1137-1146.

[6]Wensing M,Uhde E,Salthammer T.Sci.TotalEnviron.,2005,339(1/3):19-40.

[7]Salamova A,Ma Y,Venier M,Hites R A.Environ.Sci.Technol.Lett.,2014,1(1):8-14.

[8]Venier,M,Dove A,Romanak K,Backus S,Hites R.Environ.Sci.Technol.,2014,48(16):9563-9572.

[9]Yang F X,Ding J J,Huang W,Xie W,Liu W P.Environ.Sci.Technol.,2014,48(1):63-70.

[10]Hoffman K,Daniels J L,Stapleton H M.Environ.Int.,2014,63:169-172.

[11]van den Eede N,Neels H,Jorens P G,Covaci A.J.Chromatogr.A,2013,1303:48-53.

[12]Reemtsma T,Lingott J,Roegler S.Sci.TotalEnviron.,2011,409(10):1990-1993.

[13]Schindler B K,Foerster K,Angerer J.J.Chromatogr.B,2009,877(4):375-381.

[14]Cequier E,Marce R M,Becher G,Thomsen C.Anal.Chim.Acta,2014,845:98-104.

[15]Cooper E M,Covaci A,van Nuijs A L,Webster T F,Stapleton H M.Anal.Bioanal.Chem.,2011,401(7):2123-2132.

Determination of Five Organophosphate Ester Metabolites in Surface Water Samples by LC-MS/MS

LI Chuang-xiu1,ZHAO Xiao-li2,GAO Li-hong3,SHI Ya-li3,TAN Wei-qiang1*,CAI Ya-qi3*

(1.School of Environmental and Municipal Engineering,Qingdao Technological University,Qingdao266033,China;2.State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment,Chinese Research Academy of Environmental Sciences,Beijing100012,China;3.State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology,Research Center for Eco-environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing100085,China)

Abstract：A liquid chromatography-tandem mass spectrometric(LC-MS/MS) method was developed for the determination of five organophosphate ester metabolites in river water samples.The filtered water samples were enriched and purified by solid phase extraction(SPE) using a HLB cartridges,and then eluted with 6 mL methanol.The eluent was concentrated to a volume of 0.5 mL under gentle nitrogen stream and then diluted to 1 mL by initial mobile phase(50% methanol).Instrumental analysis was accomplished by HPLC-MS/MS under negative electrospray ion and multiple reaction monitoring(MRM) mode.Separation of the analytes was performed on a Luna Phenyl-Hexyl column,and a mixture of methanol and 50 mmol·L-1ammonium acetate solution was selected as mobile phase for gradient elution.The recoveries of five organophosphate ester metabolites in river samples were in the range of 57.8%-102% at a spiked concentration of 50 ng·L-1with relative standard deviations(RSD) of 2.8%-15.7%.At a spiked concentration of 10 ng·L-1,the recoveries were in the range of 54.1%-83.6% with RSDs of 5.3%-19.5%.The instrumental detection limits(IDL) ranged from 0.002 μg·L-1to 1.15 μg·L-1and the method detection limits(MDL) ranged from 0.15 ng·L-1to 4.48 ng·L-1.The matrix effect of river samples was also investigated in this study.The proposed method was successfully applied in the determination of organophosphate ester metabolites in lake water samples collected from Wuhan,Hubei.Except for DEHP,the other four OPEs metabolites were all detectable in lake water.The method showed good precision and accuracy,and was suitable for the analysis of five organophosphate ester metabolites in surface water samples.

Key words：organophosphate ester metabolites;liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS);river water；solid phase extraction

中圖分類號：O657.63；TQ314.248

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)02-0194-06

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.02.010

*通訊作者：譚偉強，副教授，研究方向：有機合成與催化，Tel：0532-85071266，E-mail：tlong958@163.com

基金項目：國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2013AA065201)；國家自然科學基金項目(21477143，21321004)

收稿日期：2015-07-21；修回日期：2015-08-20

蔡亞岐，研究員，研究方向：環境化學，Tel：010-62849239,E-mail：caiyaqi@rcees.ac.cn