左金方聯合5-FU抑制人胃癌細胞RF-48的增殖作用研究*

邱 菡，周紅祖，周禹練，余惠旻△

(1.深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518035;2.深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518020; 3.深圳大學醫(yī)學院，廣東 深圳 518060)

左金方聯合5-FU抑制人胃癌細胞RF-48的增殖作用研究*

邱 菡1，周紅祖2，周禹練3，余惠旻3△

(1.深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518035;2.深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518020; 3.深圳大學醫(yī)學院，廣東 深圳 518060)

目的:研究左金方聯合5-FU抑制胃癌RF-48細胞增殖，探討其協同增效作用。方法:Cell Counting Kit-8檢測細胞增殖率的變化，流式細胞儀檢測細胞凋亡，Hoechst 33258染色觀察細胞形態(tài)學變化。結果:左金方對HFE145細胞活力的影響很小，而小劑量的5-FU會引起較大的細胞毒性，不同濃度左金方、5-FU均能誘導RF-48細胞的凋亡;左金方聯合5-FU后對HFE145細胞存活率的影響，以及對RF-48細凋亡率的影響，與單獨用藥組比較差異有統計學意義，Hochest染色RF-48細胞出現核固縮狀和顆粒狀熒光等典型的凋亡學特征。結論:左金方與5-FU聯合用藥大幅降低了5-FU的細胞毒性作用，顯著提高了HFE145細胞的存活率，促進了人胃癌細胞RF-48的凋亡，比左金方或者5-FU單獨用藥對胃癌的治療效果更好。

左金方;5-FU;HFE145;RF-48;聯合用藥;凋亡

中國是胃癌的高發(fā)區(qū)［1-2］，目前胃癌的化療藥物泰素、多西紫杉醇、伊利替康以及各種5-氟尿嘧啶(5-FU)衍生物等雖能使胃癌的化療效果顯著提高，但其存在嚴重的毒副作用［3］。在化療中，某些中藥配合治療胃癌可以直接抑制腫瘤細胞的增殖，還可以減輕化療的毒副作用，但目前尚無具有廣泛治療作用的臨床中藥制劑問世。左金方是出自《丹溪心法》的名方，臨床常用于急慢性胃炎和消化性潰瘍的治療［4］。近年來研究還發(fā)現，它具有抗腫瘤作用［5-9］。本研究在前期研究的基礎上，采用體外培養(yǎng)人正常胃黏膜上皮細胞HFE145和人轉移性胃腺癌細胞株RF-48的方法，探討左金方和5-FU對胃癌細胞的協同增效作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國 Shella公司);DC300型倒置熒光相差顯微鏡(德國Leica公司);超凈工作臺(比利時Esco公司);Rotofix32型離心機(德國 Hettich公司);AllegraTM21R型低溫離心機(美國Coulter公司);Epics XL型流式細胞儀(美國 Coulter公司); Polar star Galaxy型酶標儀(德國BMG公司)。

1.2 主要藥物與試劑

黃連、吳茱萸均購于深圳華輝藥業(yè)有限公司，由深圳市中醫(yī)院中藥科劉志誠主任藥師鑒定，分別為毛茛科植物黃連 Coptis chinensis Franch.的干燥根莖和蕓香科植物吳茱萸 Evodia rutaecarpa(Juss) Benth.干燥近成熟的果實。Cell Counting Kit-8 (CCK-8，日本同仁化學研究所 Dojindo)、碘化丙啶(PI)、RNA酶(RNase)均購自美國 Sigma公司; DMEM培養(yǎng)基、胰酶(trypsin，美國 Gibico公司);胎牛血清(FBS，美國 Hyclone公司);Hoechst 33258 (瑞士Fluka公司);5-氟尿嘧啶(5-FU，天津金耀氨基酸有限公司，批號 1412011);Alexa FluorR 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit (美國Lifetechnology公司)。

1.3 細胞

人胃黏膜上皮細胞 HFE145、人轉移性胃腺癌細胞RF-48購自深圳大學醫(yī)學院細胞中心(細胞源自美國ATCC細胞庫)。

2 方法

2.1 藥物制備

左金方傳統湯劑凍干粉:由本實驗室提供，取30 g黃連與5 g吳茱萸，加8倍蒸餾水浸泡30 min，加水煎煮3次，每次30 min，過濾合并3次濾液，冷凍干燥，每克干粉含生藥3.98 g;經 HPLC法測定，左金方凍干粉中含小檗堿39.85%，巴馬汀9.19%，藥根堿 4.86%，吳茱萸堿 0.17%，吳茱萸次堿0.19%。將左金方凍干粉溶于去離子水中，配置成1 mg/mL的母液，實驗時用細胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。5-FU的配制方法:取適量5-氟尿嘧啶注射液原液加細胞培養(yǎng)液配制成1 mg/ml母液，實驗時用細胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

2.2 細胞培養(yǎng)

HFE145人正常胃黏膜上皮細胞、RF-48人轉移性胃腺癌細胞在10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液中，于37℃條件下，在濕度為100%、含CO2為5%(體積分數)的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.3 觀察指標和方法

2.3.1 CCK-8檢測細胞活性 取人正常胃黏膜上皮細胞HFE145對數生長期細胞，用DMEM培養(yǎng)基制成細胞懸液(5×104/mL)加入96孔板，100 μL/孔，培養(yǎng)12 h后給藥，實驗組分別加入不同濃度的供試藥物，分別培養(yǎng)24、48 h，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育4 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(OD)。其中將未經處理的對照組細胞存活率設定為100%。細胞抑制率=(1-實驗組平均 OD值/對照組平均 OD值)× 100%。

2.3.2 流式細胞儀檢測 調整人胃腺癌細胞RF-48細胞密度為2×105/mL，以1.5 mL/well種入6孔板，每組6個復孔。藥物作用24 h后，細胞刷刮取細胞，800 r/min離心5 min，去上清加入 PBS重懸，調整細胞濃度為1×106/mL。取適量于流式管中，加入工作液 500 uL，再加入熒光染料(10 uL Annexin V-FITC和5uL PI混合液)，350目尼龍網濾膜過濾去除細胞團塊，室溫避光染色15 min后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率(激發(fā)光波長用 488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測 FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI)。測定數據按流式細胞儀所配置的軟件進行數據處理，以右下代表的早期凋亡率加右上代表的中后期凋亡率的總和代表細胞凋亡率。

2.3.3 Hochest染色 －熒光顯微鏡觀察 將RF-48細胞(2×105/mL)接種于6孔板內的蓋玻片上，各實驗組按要求給予不同的處理因素后，加入新鮮配制的4%多聚甲醛(pH為7.4)，于37℃固定細胞30 min，PBS液洗2次，加5 mg/L Hochest 33258染色液染色 30 min，PBS液洗后，用封片液(20 mmol/L檸檬酸，50 mmol/L磷酸氫二鈉，50%甘油，pH 5.5)封片后熒光顯微鏡觀察、攝片。

(4)邊坡開挖預裂孔殘留孔率控制：①在開挖輪廓面上，殘留孔痕跡應均勻分布；殘留孔痕跡保存率，對完整的巖體，應達到85%以上；對較完整和較破碎的巖體，應達到60%以上；對破碎的巖體，應達到20%以上。

2.3.4 統計學方法 采用 SPSS 1010統計軟件進行統計分析，數據以均數 ±標準差 (±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 藥物對HFE145細胞存活率的影響

3.1.1 左金方對 HFE145細胞存活率的影響 CCK-8實驗結果顯示，左金方對HFE145細胞活力的影響很小，小劑量左金方能促進細胞的增殖和分裂，當給藥濃度增加到一定程度后，隨著給藥濃度的增加和作用時間的延長，細胞活力稍有減弱。圖1顯示，1.00 ug·mL－1左金方作用HFE145細胞24、48 h的細胞存活率分別為(106.68±1.65)%和(100.16±1.23)%，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

圖1 不同濃度左金方作用不同時間對HFE145細胞存活率的影響(n=6)

3.1.2 5-FU對HFE145細胞存活率的影響CCK-8實驗結果顯示，對照組細胞生長良好，5-FU對HFE145細胞活力的影響呈現“濃度-時間依賴性”的關系，即隨著給藥濃度的增加和作用時間的延長，細胞活力逐漸減弱，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。圖2顯示，小劑量的5-FU會引起細胞毒性，隨著用藥濃度增加其毒性亦增強。

圖2 不同濃度5-FU作用不同時間對HFE145細胞存活率的影響(n=6)

3.2 藥物對RF-48細胞凋亡的影響

表1、2顯示，不同濃度左金方、5-FU作用于RF-48細胞，隨著給藥濃度的逐漸增高和給藥時間的延長，RF-48細胞的凋亡率逐漸增大，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

表1 不同濃度左金方作用24 h對RF-48細胞凋亡率的影響(%)

表2 不同濃度的5-FU作用24 h對RF-48細胞凋亡率的影響(%)

3.3 聯合用藥對 HFE145和 RF-48細胞生長的影響

3.3.2 聯合用藥對 RF-48細胞凋亡的影響圖3、4顯示，從流式細胞的檢測結果可以看出，1.00 ug·mL－1左金方分別與50.00 ug·mL－1、100.00 ug· mL-15-FU聯合用藥作用于RF-48細胞24 h后，細胞凋亡率大幅度提高(前期和中后期都有增加，以中后期占主導)，聯合用藥組與左金方和5-FU單獨用藥比較差異有統計學意義(P＜0.05)，即聯合用藥組誘導凋亡的作用優(yōu)于各單獨用藥組。

表3 左金方與5-FU聯合用藥作用不同時間對HFE145細胞存活率的影響

圖3 各組Annexinⅴ/PI凋亡檢測圖

3.4 左金方和5-FU單獨與聯合對人胃癌RF-48細胞形態(tài)學的影響

從實驗結果可看出，經Hoehest33258熒光染色后，熒光顯微鏡下見空白組RF-48細胞膜均完整，核形態(tài)飽滿，核質著色淺，密度均勻一致(圖 5A); 1.00 ug·mL－1左金方、50.00 ug·mL－15-FU、100.00 ug·mL－15-FU作用24 h后，細胞出現典型凋亡形態(tài)特征，細胞膜皺縮，細胞核相對變小，熒光明顯增強，呈高度塊狀(圖5B、5C、5D);左金方 +5-FU(1.00 +50.00)、左金方+5-FU(1.00+100.00)聯合用藥作用24 h，細胞除上述特征外，可見凋亡小體數目明顯多于各單獨用藥組(見圖5E、5F)。

圖4 各組腫瘤細胞凋亡率圖

圖5 左金方和5-FU單獨與聯合對人胃癌RF-48細胞形態(tài)學的影響(×200)。

4 討論

胃癌的發(fā)生是一個多因素、多步驟的復雜過程。大量的研究證明，中藥配合化療治療胃癌可明顯改變癥狀，增加有效率，延長生存期，防復發(fā)、抗轉移，平衡和調節(jié)機體內環(huán)境，提高與改善機體免疫能力，保護重要器官功能，減輕化療毒副反應，提高生存質量［10-12］。我們前期研究也發(fā)現［7-9］，左金方能誘導胃癌細胞SGC-7901(胃中分化腺癌細胞系)和MGC803 (胃低分化腺癌細胞系)的凋亡，聯合5-FU后能顯著提高正常組織細胞的存活率，大幅降低5-FU的毒副作用，其作用優(yōu)于左金方或5-FU單獨用藥組。

本研究選用HFE145(人正常胃黏膜上皮細胞)和RF-48(低分化、高轉移)開展以上研究。CCK-8的結果顯示，藥物作用 HFE145細胞24 h后，左金方對細胞活力的影響很小，5-FU有顯著的細胞毒性作用，二者聯合用藥后，顯著提高了正常胃黏膜上皮細胞的存活率，大幅降低了5-FU的毒副作用。流式細胞儀的檢測結果顯示，左金方和5-FU均能誘導胃癌細胞RF-48的凋亡，二者聯合用藥后，能顯著促進胃癌細胞RF-48的凋亡，其作用優(yōu)于左金方和5-FU單獨用藥。Hoehest33258熒光染色從形態(tài)學角度進一步證明，左金方與5-FU聯合用藥比左金方或5-FU單獨用藥對胃癌的治療效果更好。

目前，5-FU是臨床消化系統中胃癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌、食管癌等普遍使用的化療藥物，長期使用會產生耐受，且5-FU毒副作用大，大劑量使用會增加病人的痛苦。本研究發(fā)現，左金方具有促進RF-48細胞凋亡的作用，并隨藥物濃度的升高而增強。左金方聯合5-FU作用于RF-48細胞會產生協同作用，其作用機制尚不明確。本研究成果對降低臨床抗胃癌化療藥物的毒副作用，提高治療效果，開發(fā)可用于臨床治療胃癌的左金方復方制劑，都具有重大的臨床意義。

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Study on the Effect of Zuojin Decoction Combined With 5-Fu Inhibits the Proliferation of Human Gastric Cancer Cell Line Rf-48

QIU Han1，ZHOU Hong-zu2，ZHOU Yu-lian3，YU Hui-min3△
(1.Shenzhen Second People's Hospital，Shenzhen 518035，China;2.Shenzhen Chinese Medicine Hospital，Shenzhen 518020，China;3.School of Medicine，Shenzhen University，Shenzhen 518060，China)

Objective:To investigate the synergistic effect of ZuoJinFang combined with 5-Fu on inhibiting the cell prociferation of Human Gastric Carcinoma RF-48 cells.Methods:The growth inhibitions of HFE145 cell were analyzed by MTT assay，the apoptosis rates of RF-48 cell were studied by flow cytometry，and the cell morphology changes of RF-48 cell were showed by Hoechst 33258 staining.Results:ZuoJinFang has little impact on the cell viabilities，and 5-FU causes larger cell toxicity at low doses.The RF-48 cell apoptosis can be induced by both ZuoJinFang and 5-FU.After the cells treated by ZuoJinFang combined with 5-FU(1.00+50.00 or 1.00+100.00 ug·mL－1)for 24 h，the influences not only on HFE145 cell survival rate but also on RF-48 apoptosis rate，compared with ZuoJinFang and 5-Fu group separately，the differences were statistically significant.Hochest staining results showed RF-48 cells nuclear condensation，granular fluorescence and other typical features of apoptosis.Conclusion:ZuoJinFang combined with 5-FU，greatly reduced the side effects of 5-FU，significantly increased the survival rates of the Human Gastric Mucosal Epithelial Cell HFE145 cells，promoted apoptosis of gastric carcinoma RF-48 cells，and the effects of drug combination were stronger than ZuoJinFang or 5-Fu separately under the same conditions.

ZuoJinFang;5-FU;HFE145;RF-48;Drug combination;Apoptosis

R285.5

:B

:1006-3250(2016)07-0929-04

2016-01-14

廣東省中醫(yī)藥局項目(20141253)-左金方顆粒劑與湯劑誘導人胃癌細胞SGC-7901凋亡的實驗研究

邱 菡(1982-)，女，廣東人，主管藥師，從事臨床藥學研究。

△通訊作者:余惠旻(1972-)，男，新疆人，醫(yī)學博士，藥學碩士，從事中藥及其復方抗腫瘤的臨床與研究，Tel:0755-86671902，E-mail:yuhuimin@szu.edu.cn。