柴胡皂苷對(duì)抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用*

蔡珍珍徐廣有董海影溫秋婷于秀文王紹清張曉杰張靜艷

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柴胡皂苷對(duì)抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用*

蔡珍珍①徐廣有①董海影①溫秋婷①于秀文①王紹清①?gòu)垥越堍購(gòu)堨o艷①

【摘要】目的：探討柴胡皂苷對(duì)抑郁模型大鼠行為及海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。方法：采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只SD雄性大鼠分為對(duì)照組、模型組、氟西汀組和柴胡皂苷組，每組15只。采用慢性不可預(yù)見性應(yīng)激刺激（CUMS）加孤養(yǎng)方式復(fù)制抑郁模型。于造模第2天開始，對(duì)氟西汀組和柴胡皂苷組大鼠進(jìn)行灌胃給藥。在實(shí)驗(yàn)的第1、7、14、21天，通過糖水消耗量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠行為學(xué)改變。采用RT-PCR法對(duì)各組大鼠腦海馬神經(jīng)元JNK、Bad mRNA進(jìn)行定量分析。結(jié)果：對(duì)照組、柴胡皂苷組、氟西汀組第14及21天糖水偏愛度均高于模型組，JNK、Bad mRNA表達(dá)量均低于模型組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：柴胡皂苷可以有效控制大鼠抑郁癥狀，其機(jī)制可能與降低海馬組織中JNK、Bad蛋白表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】柴胡皂苷； 海馬； 抑郁； 凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1

①齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 黑龍江 齊齊哈爾 161006

First-author’s address：Qiqihar Medical College，Qiqihar 161006，China

抑郁癥的發(fā)病機(jī)制目前有多種假說，有觀點(diǎn)認(rèn)為抑郁易損基因與心理應(yīng)激的共同作用，導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、神經(jīng)元凋亡與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)[1]。基于尋找抗抑郁作用的靶治療點(diǎn)，科學(xué)界開展了大量的研究，并取得一定的進(jìn)展[2-3]。柴胡皂苷是柴胡的主要成分，具有解郁醒腦、改善抑郁樣癥狀的作用，但機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)從柴胡皂苷抗凋亡、緩解神經(jīng)元損傷角度探討其抗抑郁作用機(jī)制，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2～3月齡清潔級(jí)雄性健康SD大鼠60只，體重180～200 g，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（遼）2008-0002。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為正常對(duì)照組、模型組、氟西汀組和柴胡皂苷組共四組，每組15只。

1.2 藥品及試劑 柴胡皂苷（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供，批號(hào)：ZL043583DY），鹽酸氟西汀膠囊（蘇州俞氏藥業(yè)有限公司。批號(hào)：H20093454），PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒由寶生物工程有限公司提供。

1.3 儀器 PCR System擴(kuò)增儀2700為Applied Biosystems公司產(chǎn)品，熒光定量PCR儀ABI7300為ABI公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 造模及給藥 對(duì)照組不給予任何刺激。其余各組大鼠均分籠飼養(yǎng)并進(jìn)行21 d慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（CUMS）刺激，方法根據(jù)Katz法進(jìn)行改進(jìn)[4]。于造模第2天開始氟西汀組采用氟西汀1.2 mg/（kg·d），柴胡皂苷組采用柴胡皂苷25 mg/（kg·d）進(jìn)行灌胃給藥，對(duì)照組及模型組給予等量生理鹽水。

1.4.2 大鼠行為學(xué)評(píng)價(jià) 在實(shí)驗(yàn)的第1、7、14、21天測(cè)定1 h大鼠飲用1％蔗糖水及純水量，計(jì)算大鼠糖水偏愛度（糖水偏愛度＝糖水消耗量/總液體消耗量×100％）。

1.4.3 RT-PCR法檢測(cè)JNK、Bad的mRNA含量 分離海馬，按RNAiso Reagent試劑盒操作流程提取海馬組織總RNA并測(cè)驗(yàn)RNA純度及濃度。按照SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）kit試劑盒說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)引物：JNK-F1：5’-CTGTGCTAATGACCTGCTTGTTG-3’，JNK-R1：5’-TACCCGAGAGTTTGGGCTGT-3’，Bad-F1：5’-AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG-3’，Bad-R1：5’-GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3’，按下列公式計(jì)算△△Ct值：△CT（test）＝CT（target，test）-CT（ref，test），△CT（calibritor）＝CT（target，cal）-CT（ref，cal），△△CT＝△CT（test）-CT（calibritor），各樣品mRNA表達(dá)水平均用2-△△CT表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 13.0軟件包對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)使用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)評(píng)價(jià) 對(duì)照組、柴胡皂苷組、氟西汀組第14及21天糖水偏愛度均高于模型組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

2.2 柴胡皂苷對(duì)大鼠海馬JNK、Bad mRNA表達(dá)的影響 對(duì)照組、柴胡皂苷組、氟西汀組JNK、Bad mRNA表達(dá)量均低于模型組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表1　各組大鼠糖水偏愛度比較（±s）　％

表1　各組大鼠糖水偏愛度比較（±s）　％

*與模型組比較，P＜0.01

組別　　實(shí)驗(yàn)前　　第7天　　第14天　　第21天對(duì)照組（n＝15）　69.47±7.09　72.80±6.53　77.91±1.76*　82.13±10.01*模型組（n＝15）　 68.39±11.05　66.73±8.63　51.77±13.87　37.62±12.64柴胡皂苷組（n＝15）　67.28±9.58　65.71±6.73　72.23±12.07*　76.58±11.72*氟西汀組（n＝15）　68.77±9.43　65.49±6.40　74.27±13.74*　75.66±12.36*

表2　各組大鼠JNK、Bad mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表2　各組大鼠JNK、Bad mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

*與模型組比較，P＜0.01

組別　JNK mRNA　Bad mRNA對(duì)照組（n＝15）　 1.01±0.02*　1.27±0.10*模型組（n＝15）　5.23±0.18　 4.26±0.47柴胡皂苷組（n＝15）　3.13±0.20*　3.41±0.25*氟西汀組（n＝15）　2.76±0.14*　3.01±0.45*

3 討論

隨生活環(huán)境改變，影響人類健康的心境疾病逐年增多，其中尤以抑郁癥為著，為探討抗抑郁新藥國(guó)內(nèi)外科研團(tuán)隊(duì)開展了多年的研究[4-5]。抑郁癥的機(jī)制復(fù)雜，根治不徹底是現(xiàn)今醫(yī)療界的難題[6]。本實(shí)驗(yàn)采用孤養(yǎng)結(jié)合CUMS復(fù)制大鼠抑郁模型，探討柴胡皂苷的抗抑郁作用。

本實(shí)驗(yàn)采用糖水消耗量檢測(cè)評(píng)價(jià)大鼠抑郁程度。隨造模時(shí)間增加，大鼠抑郁樣癥狀加重，糖水偏愛度減少證實(shí)其快感缺失嚴(yán)重。通過糖水消耗實(shí)驗(yàn)證實(shí)本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制大鼠抑郁模型。

JNK屬于細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedprotein kinase kinase kinase，MAP3Ks）家族的成員[8]。JNK蛋白可被紫外線照射、炎性因子等多種凋亡刺激所激活[9-10]。激活的JNK又可導(dǎo)致下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡。JNK激活后可通過兩條途徑發(fā)揮作用：一是上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)從而激活死亡受體凋亡通路，另一條途徑是通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員的活性參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路。

凋亡蛋白Bad是Bcl-2家族成員之一。Bad在外周及中樞神經(jīng)元、淋巴細(xì)胞、生殖細(xì)胞及許多上皮細(xì)胞中均有表達(dá)[11-12]。Bad在凋亡刺激信號(hào)作用于促凋亡成員時(shí)發(fā)生構(gòu)型改變，易位并插入線粒體外膜發(fā)揮促凋亡活性[13]。

綜上所述，本研究采用慢性不可預(yù)見性應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng)，成功建立抑郁大鼠模型，主要表現(xiàn)為糖水消耗量減少。本實(shí)驗(yàn)通過柴胡皂苷與氟西汀對(duì)抑郁大鼠進(jìn)行灌胃給藥后，大鼠海馬神經(jīng)元中JNK蛋白表達(dá)明顯降低，其下游蛋白亦發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，Bad蛋白呈現(xiàn)低表達(dá)。說明柴胡皂苷可能通過抑制海馬神經(jīng)元JNK蛋白表達(dá)，下調(diào)Bad蛋白表達(dá)，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

目前抑郁癥的病理機(jī)理尚不完全明確[14-15]。但結(jié)合大鼠糖水消耗量的改善，可以證實(shí)，柴胡皂苷抗抑郁作用明顯，其抗抑郁作用的機(jī)制可能與降低大鼠海馬組織中的JNK、Bad蛋白表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]鐘靜玫，郭強(qiáng)，武紹遠(yuǎn)，等.抑郁癥與氧化應(yīng)激[J].中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2011，20（7）：665-666.

[2]樊蔚虹，姚建平，楊清，等.柴胡疏肝散干預(yù)卒中后抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究[J]中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（22）：216-218.

[3] Wester J C，Contreras D.Differential modulation of spontaneous and evoked thalamocortical network activity by acetylcholine level in vitro[J].The Journal of Neuroscience，2013，33（45）：17 951-17 966.

[4] Han D，Wang E C.Remission from depression：a review of venlafaxine clinical and economic evidence[J].Pharmacoeconomics，2005，23（6）：567-581.

[5] Wu J J，Bennett A M.Essential role for mitogen-activated protein （MAP）kinase phosphatase-1 in stress-responsive MAP kinase and cell survival signaling[J].J Biol Chem，2005，280（16）：16 461-16 466.

[6] Porter R J，Bowie C R，Jordan J，et al.Cognitive remediation as a treatment for major depression：a rationale，review of evidence and recommendations for future research[J].Australian and New Zealand Journal of Psychiatry，2013，47（12）：1165-1175.

[7]張曉杰，董海影，孫玉榮，等.柴胡疏肝散對(duì)抑郁模型大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（1）：43-45.

[8]張微.蛋白激酶D在H2O2介導(dǎo)的ASK1-JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路中的作用及其機(jī)制研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2007.

[9] Zhang J，Bowden G T.Activation of p38 MAP kinase and JNK pathways by UVA irradiation[J].Photochem Photobiol Sci，2012，11（1）：54-61.

[10] Lisanti M P，Tsirigos A，Pavlides S，et al.JNK1 stress signaling is hyper-activated in high breast density and the tumor stroma：connecting fibrosis，inflammation，and stemness for cancer prevention[J].Cell Cycle，2014，13（4）：580-599.

[11] Cieslak D，Lazou A.Regulation of BAD protein by PKA，PKCdelta and phosphatases in adult rat cardiac myocytes subjected to oxidative stress[J].Mol Cells，2007，24（2）：224-231.

[12] Ohkubo N，Vitek M P，Morishima A，et al.Reelin signals survival through Src-family kinases that inactivate BAD activity[J].J Neurochem，2007，103（2）：820-830.

[13] Maiuri M C，Criollo A，Tasdemir E，et al.BH3-only proteins and BH3 mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X（L）[J]. Autophagy，2007，3（4）：374-376.

[14]榮華，董海影，張靜艷，等.β-細(xì)辛醚對(duì)抑郁模型大鼠海馬CA3區(qū)超微結(jié)構(gòu)的改變及腦組織ERK蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（36）：10-12.

[15]金銘，蔡珍珍，董海影，等.β-細(xì)辛醚對(duì)抑郁模型大鼠海馬組織及Bax、Bcl-2的影響[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11 （18）：36-38.

Protective Effect of Saikosaponin on the Hippocampal Neuron of Depression Model Rats

/CAI Zhenzhen，XU Guang-you，DONG Hai-ying，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（03）：028-030

【Abstract】Objective：To investigate the protective effect of Saikosaponin on the behavior and the apoptosis of hippocampus neurons in depression model rats.Method：60 SD rats were randomly divided into the control group，the model group，the Saikosaponina group and the Fluoxetine group，15 rats in each group.Solitary and chronic mild unpredictability stimulation were used to copy the model of depression.From the second day after modeling successfully，the Saikosaponina group and the Fluoxetine group were given intragastrical administration.On the first，seventh，fourteenth and twenty-first day of the experiment，sugar water consumption experiment was used to detect the behavioral change of the rats.Real-time PCR was used for the quantitative analysis of JNK，Bad mRNA. Result：The preference degree of sugar water in the the control group，the Saikosaponina group and the Fluoxetinebook=29,ebook=33group was higher than that in the model group，the expression quantities of JNK，Bad mRNA in the the control group，the Saikosaponina group and the Fluoxetine group were lower than those in the model group，the differences were all statistically significant（P＜0.01）.Conclusion：Saikosaponina can effectively control the depressive symptoms of rats. Its mechanism may be related to the decreasing of JNK，Bad protein expression in hippocampus.

【Key words】Saikosaponin； Hippocampus； Depression； Apoptosis signal regulating kinase-1

收稿日期：（2015-12-09） （本文編輯：王利）

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.03.009

通信作者：張靜艷

*基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（12531784）