龍葵生物堿提取及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

周吉芳 黃越燕

摘要：龍葵為雙子葉茄科茄屬一年生草本植物，生物堿類化合物是龍葵的主要生物活性成分，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。目前，龍葵生物堿的提取方法有溶劑提取、超聲提取、微波提取、超臨界萃取、柱層析等，檢測(cè)方法有酸性染料比色法、薄層掃描法、高效液相色譜法、反相高效液相色譜法、超高效液相色譜法等。本文對(duì)近年來龍葵生物堿提取及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為龍葵堿的研究和開發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：龍葵生物堿；提取；檢測(cè)；綜述

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.040

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）04-0133-04

Research Progress in Extraction and Detection Methods of Alkaloids from Solanum Nigrum ZHOU Ji-fang， HUANG Yue-yan （College of Medicine， Jiaxing University， Jiaxing 314001， China）

Abstract： Solanum Nigrum is a kind of dicotyledon solanaceae annual herb， and alkaloids are its main bioactive constituents， with good antitumor activity. The current extraction methods for alkaloids include solvent extraction， ultrasonic extraction， microwave extraction， supercritical fluid extraction， and column chromatography etc， while the detection methods include acid dye colorimetry， thin layer scanning， high performance liquid chromatography， reversed-phase high performance liquid chromatography， and ultra-high performance liquid chromatography etc. This article reviewed the research progress in extraction and detection methods of alkaloid from Solanum Nigrum in recent years， so as to provide references for further research and development of alkaloid from Solanum Nigrum.

Key words： alkaloids from Solanum Nigrum； extraction； detection； review

龍葵Solanum nigrum L.系雙子葉茄科茄屬一年生草本植物，全國(guó)各地均有分布。其性寒，味苦、微甘，有小毒，有清熱解毒、活血散瘀、利水消腫、止咳祛痰功效。龍葵全草含生物堿、多糖、皂苷等多種成分，其中龍葵生物堿類成分包括龍葵堿（Solanine）、龍葵定堿（Solanigridine）、澳洲茄堿（Solasonine）、澳洲茄邊堿（Solamargine）、澳洲茄明堿（Solasodamine）和糖苷生物堿（glycoalkaloids）等[1]，其抗腫瘤作用及其機(jī)制研究是近年的研究熱點(diǎn)[2]。茲綜述近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)龍葵生物堿提取分離和檢測(cè)方面新技術(shù)的研究現(xiàn)狀，分析其原理及優(yōu)缺點(diǎn)，以期為龍葵生物堿研究和開發(fā)提供參考。

1 提取方法

1.1 傳統(tǒng)提取方法

1.1.1 水或酸水回流提取法 堿性較強(qiáng)的生物堿在植物體中多成鹽，可溶于水；而堿性較弱或中性生物

基金項(xiàng)目：浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y201431468）；嘉興市科技局科技項(xiàng)目（2009AY2067）；嘉興學(xué)院校級(jí)SRT項(xiàng)目（2014年）；浙江省教育科學(xué)規(guī)劃課題（2015SCG060）

堿則以不穩(wěn)定的鹽或游離堿的形式存在。因此，可采用0.5%～1%的乙酸、硫酸、鹽酸等作為提取溶劑，提取液經(jīng)濃縮后，再以堿化使生物堿游離出來，用有機(jī)溶劑萃取。周氏[3]采用乙醇回流、水回流及乙醇滲漉法分別提取龍葵總生物堿，結(jié)果水提取的總堿得率為1.05%，低于乙醇回流和乙醇滲漉。張氏等[4]采用80%乙醇、1%鹽酸、3%醋酸分別從龍葵中提取澳洲茄邊堿，提取率分別為0.51、0.39、0.28 mg/g。黃氏等[5]采用酸水回流提取龍葵生物堿用于體外抑瘤細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，在龍葵粉末中加入15倍量的2 mol/L HCl與90%乙醇1∶4（V∶V）的混合溶劑，密閉浸泡后加熱回流提取2次，每次3 h，提取液回收乙醇后濃縮至浸膏，加酸溶解后用氯仿萃取，水層調(diào)節(jié)pH值至堿性，棄去上清，收集沉淀，干燥后得到龍葵堿。以水或酸水為提取溶劑，操作簡(jiǎn)便，成本低，但提取次數(shù)多，提取液體積大、雜質(zhì)多，濃縮和后續(xù)處理較困難。

1.1.2 醇回流提取法 游離生物堿及其鹽類一般能溶于甲醇和乙醇，因甲醇毒性較大，故常用乙醇作為生物堿的提取溶劑。劉氏等[6]采用乙醇提取龍葵生物堿，分別考察了乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間三因素，確定的最佳工藝條件為乙醇濃度90%、提取時(shí)間5 h、提取溫度40 ℃，提取率可達(dá)1.8%～2.7%。張氏等[4]在研究澳洲茄邊堿的提取工藝時(shí)發(fā)現(xiàn)，提取溶劑用量對(duì)提取率影響最大，回流次數(shù)影響最小，經(jīng)正交試驗(yàn)得到最佳提取工藝為料液比1∶20時(shí)用80%乙醇回流提取2次、每次4 h，澳洲茄邊堿的平均提取率為0.621 mg/g。該研究認(rèn)為，酸水中加熱易導(dǎo)致澳洲茄邊堿水解，故不宜采用酸水熱浸或回流提取。唐氏等[7]用80%乙醇回流對(duì)龍葵藥材提取后，經(jīng)純化用于抗腫瘤活性研究，其提取工藝為粗粉用12倍量80%乙醇回流提取2次，每次2 h，回收乙醇后調(diào)節(jié)pH=9，離心得到沉淀，經(jīng)干燥后用甲醇溶解拌樣，硅膠柱分離，依次用氯仿-甲醇極性遞增梯度洗脫，當(dāng)氯仿-甲醇8∶1時(shí)洗脫得粗澳洲茄邊堿，經(jīng)甲醇重結(jié)晶得澳洲茄邊堿。王氏等[8]采用Box-Behnken效應(yīng)面法考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素對(duì)龍葵總生物堿醇提工藝的影響，結(jié)果確定最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)63.72%，料液比1∶41.23，提取時(shí)間54.93 min，提取2次，龍葵總生物堿提取率為1.40 mg/g。

1.2 現(xiàn)代提取分離方法

隨著科技發(fā)展，一些新技術(shù)開始用于生物堿的提取，如超臨界流體萃取、生物酶法、膜分離技術(shù)、分子印跡技術(shù)等，能夠提高提取效率，降低過程能耗，保持生物堿的品質(zhì)和活性。其中超聲提取、微波提取、超臨界流體提取等方法已在龍葵生物堿類化合物的提取過程中得到應(yīng)用。

1.2.1 超聲提取法 超聲波提取（UE）是利用超聲波產(chǎn)生的高頻機(jī)械振動(dòng)波在溶液體系中產(chǎn)生的空化作用，使植物細(xì)胞壁破壞和溶劑快速滲透，從而使細(xì)胞中的成分溶解于溶劑，實(shí)現(xiàn)固液萃取分離。UE具有時(shí)間短、效率高、節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)，可用于熱敏性成分的提取。

欒氏等[9]采用超聲輔助提取龍葵生物總堿，在傳統(tǒng)醇提的最佳工藝基礎(chǔ)上，分別考察了提取時(shí)間和超聲頻率對(duì)提取效果的影響，結(jié)果采用頻率59 kHz超聲輔助提取30 min得到的生物堿收率略高于傳統(tǒng)乙醇提取。該方法所用時(shí)間短，不需另外加熱，是節(jié)能可行的提取方式。 1.2.2 微波提取法 微波提?。∕AE）是利用微波與介質(zhì)的離子和偶極子分子的相互作用，促使介質(zhì)轉(zhuǎn)動(dòng)能力躍遷，加劇熱運(yùn)動(dòng)，使細(xì)胞壁破裂，胞外溶劑易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，溶解并釋放胞內(nèi)產(chǎn)物。MAE具有加熱均勻、熱效率高、節(jié)能省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)。劉氏等[10]研究了龍葵生物堿的MAE技術(shù)，以酸性染料比色法為分析手段，選取提取時(shí)間、提取功率及料液比等因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，得到最佳提取工藝是以95%乙醇為溶劑、料液比1∶20、在585 W功率下提取8 min，并認(rèn)為微波作用對(duì)龍葵總生物堿結(jié)構(gòu)基本無破壞影響。么氏等[11]比較了回流、微波和超臨界二氧化碳（CO2）萃取3種方法對(duì)龍葵總生物堿的提取作用，認(rèn)為最佳提取方法為MAE。但MAE受提取溶劑、提取時(shí)間、提取溫度等因素影響，選擇不同參數(shù)調(diào)節(jié)，會(huì)得到不同提取效果。

1.2.3 超臨界流體萃取法 超臨界流體是處于臨界溫度和臨界壓力以上的流體，兼有氣體和液體的雙重特性，既具有與氣體相當(dāng)?shù)母邤U(kuò)散系數(shù)和低黏度，又具有與液體相近的密度，對(duì)物質(zhì)具有良好的溶解力，可作溶劑進(jìn)行萃取分離。CO2因無色無毒、無腐蝕、化學(xué)惰性、安全價(jià)廉、高純度等優(yōu)點(diǎn)，是首選的清潔型工業(yè)萃取劑。么氏等[11]采用超臨界CO2流體萃取探索龍葵果總生物堿的提取工藝，以萃取溫度、壓力和時(shí)間為影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)和分析，確定最佳條件為萃取溫度50 ℃、萃取壓30 MPa、萃取時(shí)間100 min。超臨界流體萃取法具有萃取和分離的雙重作用，提取效率高，節(jié)能明顯，無有機(jī)溶劑殘留，無環(huán)境污染，但僅適于分子量較小、低極性化合物的萃取，且因其生產(chǎn)成本和設(shè)備投資高，故多用于實(shí)驗(yàn)室研究，尚未用于工業(yè)生產(chǎn)。

1.2.4 柱層析法 該法是將固定相裝于柱內(nèi)，流動(dòng)相為液體，樣品沿豎直方向由上而下移動(dòng)可達(dá)到分離提取的目的。李氏等[12]采用柱層析方法分離龍葵中的化學(xué)成分，龍葵藥粉以10倍量80%乙醇提取2次后，減壓回收乙醇，經(jīng)HPD100大孔樹脂分離純化，分別用水、15%乙醇除雜，收集70%乙醇洗脫部分，回收乙醇，調(diào)pH=9，靜置離心，所得沉淀上葡聚糖凝膠LH-20純化，可得澳洲茄堿、澳洲茄邊堿純品。

2 檢測(cè)方法

2.1 酸性染料比色法

生物堿鹽與酸性染料溴甲酚綠在醋酸-醋酸鈉緩沖液中形成有色離子對(duì)化合物，可被有機(jī)溶劑定量萃取，用比色法測(cè)定該有機(jī)相溶液的吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線可確定生物堿含量。王氏等[8]在研究龍葵總生物堿提取工藝時(shí)采用酸性染料比色法，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定總生物堿的含量。

2.2 薄層掃描法

薄層掃描法是用一定波長(zhǎng)的光照射在薄層板上，對(duì)薄層色譜有紫外光和可見光吸收的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，掃描得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)可用于藥品的鑒別、檢查和含量測(cè)定，具有分離效能高、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。梁氏等[13]用薄層掃描法測(cè)定龍葵中茄堿的苷元澳洲茄胺的含量，樣品及對(duì)照品以苯-甲醇（10∶2）為展開劑，0.5 g/L多聚甲醛的磷酸溶液為顯色劑，于薄層掃描儀上進(jìn)行測(cè)定：λS=510 nm，λR=700 nm。結(jié)果顯示，澳洲茄胺在1.965～11.79 μg呈一不通過原點(diǎn)的直線，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法定量，測(cè)得龍葵果實(shí)及全草中澳洲茄胺含量分別為1.16%、0.092 8%。

2.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）采用了梯度洗脫裝置，應(yīng)用范圍廣、分離效能高、靈敏度高、分析速度快，可用于高沸點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量大、熱穩(wěn)定性差、性質(zhì)和結(jié)構(gòu)類似生物堿的分離及分析，因此在龍葵生物堿類的含量檢測(cè)中應(yīng)用較多[14-16]。袁氏等[17]采用HPLC測(cè)定龍葵中澳洲茄堿，采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm），以乙腈-1%磷酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果顯示，澳洲茄堿在0.812～8.120 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，r=0.999 8，平均加樣回收率為100.22%。羅氏等[18]采用HPLC對(duì)龍葵中澳洲茄胺的含量測(cè)定進(jìn)行探索，以甲醇-酸水超聲提取龍葵生物堿，在回流條件下對(duì)生物堿苷進(jìn)行酸性水解，得到澳洲茄胺，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，色譜柱為Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm），乙腈-0.05%七氟丁酸（30∶70）體系為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。結(jié)果澳洲茄胺線性范圍在102～612 μg/mL（r=0.999 9），加樣回收率96.0%，RSD為3.35%。李氏等[19]通過HPLC測(cè)定澳洲茄胺鹽酸鹽含量，色譜柱為ZorbaxExtend-C18（250 mm×4.5 mm），乙腈-甲醇-乙酸銨為流動(dòng)相（60∶35∶5），檢測(cè)波長(zhǎng)204 nm，測(cè)定得澳洲茄胺鹽酸鹽在0.8～160 mg/L時(shí)線性關(guān)系良好，平均回收率為98.6%。李氏等[12]測(cè)定龍葵藥材澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量，色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6 mm×150 mm），流動(dòng)相為乙腈-2 mmol/L Na2HPO4水溶液（39∶61），檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，結(jié)果澳洲茄堿在0.395～6.32 μg（r=0.999 6）線性關(guān)系良好，澳洲茄邊堿在0.40～6.40 μg（r=0.999 9）線性關(guān)系良好。

2.4 反相高效液相色譜法

反相高效液相色譜法（RP-HPLC）的典型固定相是十八烷基鍵合硅膠，典型流動(dòng)相是甲醇和乙腈。袁氏等[20]采用RP-HPLC同時(shí)分析龍葵中3種甾體生物堿，采用Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm）色譜柱，以乙腈-1%磷酸為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，于205 nm波長(zhǎng)檢測(cè)，梯度洗脫分離澳洲茄堿、澳洲茄邊堿和khasianine 3種生物堿。結(jié)果澳洲茄堿含量測(cè)定的線性范圍為0.860～10.320 μg（r=0.999 7），澳洲茄邊堿含量測(cè)定的線性范圍為0.726～8.710 μg（r=0.999 7），khasianine含量測(cè)定的線性范圍為0.696～8.352 μg（r=0.999 8），平均回收率分別為100.18%、99.08%、99.88%。表明該方法簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確度高。

2.5 超高效液相色譜法

李氏等[21]建立澳洲茄堿、澳洲茄邊堿和khasianine超高效液相色譜同時(shí)檢測(cè)方法，采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×250 mm，1.7 μm），甲醇-0.5%乙酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，結(jié)果3個(gè)成分依次在0.865～17.300 μg、0.730～14.600 μg、0.700～14.000 μg內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9），平均加樣回收率分別為98.86%、98.91%、98.27%，均RSD<1.50%。

3 展望

龍葵生物堿類化合物是龍葵具有生理活性的重要成分，在傳統(tǒng)提取方法的基礎(chǔ)上合理使用新技術(shù)輔助提取或合用，可有效改善提取及純化效果。但超臨界萃取等方法還存在分離產(chǎn)量低、成本高等問題，如何將一些提取新技術(shù)用到生產(chǎn)中去，還有許多問題有待解決。隨著含量分析測(cè)定技術(shù)的發(fā)展，多組分同時(shí)檢測(cè)逐漸成為龍葵生物堿類化合物分析領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)，HPLC因其高分辨率、高靈敏度、高效性、重現(xiàn)性好、適用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，用于龍葵生物堿的分離和鑒定具有較好的優(yōu)勢(shì)。

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（收稿日期：2015-03-21）

（修回日期：2015-06-27；編輯：梅智勝）