淫羊藿水煎液對小鼠不同免疫水平模型的干預作用

楊曉旭，王　宇，韓貞愛，薛　迪，劉樹民

(黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040)

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·實驗研究·

淫羊藿水煎液對小鼠不同免疫水平模型的干預作用

楊曉旭，王宇，韓貞愛，薛迪，劉樹民*

(黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040)

摘要：目的通過構建3個小鼠免疫系統模型，研究淫羊藿水煎液(WDE)對小鼠免疫系統的綜合作用關系，從而為淫羊藿臨床治療免疫系統疾病提供理論依據。方法通過構建小鼠遲發型特異性超敏反應(DTH)模型、以碳粒廓清法檢測的正常小鼠和非特異性免疫低下小鼠模型、刀豆蛋白(ConA)誘導的體外小鼠脾淋巴細胞增殖3種模型,考察淫羊藿對不同水平免疫模型的調節作用。結果WDE能夠有效降低超敏反應下的脾系數和炎癥因子IL-2、IL-4水平(P<0．01)；碳粒廓清法中，給藥組與空白組相比WDE可使正常生理狀態下小鼠的脾系數和廓清指數明顯降低(P<0.05)，而同樣給予環磷酰胺的模型給藥組與模型組相比WDE可使免疫低下小鼠的脾系數、胸腺系數、廓清指數、吞噬指數均明顯升高(P<0.05)；此外，WDE能顯著抑制ConA誘導的脾淋巴細胞增殖反應(P<0．01)，且其作用強度呈劑量依賴性。結論WDE對DTH小鼠和正常小鼠均有免疫抑制作用，體外亦能抑制脾淋巴細胞的增殖，并且對免疫低下小鼠有顯著的免疫增強和保護作用，淫羊藿水煎液可能對免疫系統有雙向調節作用。

關鍵詞：淫羊藿水煎液；免疫系統；調節作用

淫羊藿(epimedii folium)為小檗科植物，別名淫羊藿，味辛、甘，性溫，始載于《神農本草經》，具有補腎陽，強筋骨，祛風濕功效，是傳統的補虛壯陽中藥材。現代藥理學研究[1-2]表明，淫羊藿具有調節機體免疫功能，增強雄性生殖功能、抗骨質疏松、抗炎抗病毒抗氧化、改善心血管系統病變和促進骨髓造血系統功能等作用。近年來，大量實驗研究[3-4]表明，淫羊藿及其提取物對機體免疫功能有顯著增強和調節作用，但以往研究針對的模型過于單一，綜合性分析不強。本研究通過建立小鼠多個免疫功能評價模型，分析淫羊藿水煎液作用下各個模型的指標變化，從正常生理狀態、超敏反應病理狀態和免疫低下病理狀態總結其對小鼠免疫系統作用的綜合性研究，從而為中藥臨床治療免疫系統疾病提供理論依據。

1材料

1．1實驗動物KM小鼠由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，保持飼養環境溫度22 ℃，8:00 am到8:00 pm人工燈光照明，標準小鼠飼料喂養，自由飲水。

1．2藥材與試劑淫羊藿藥材購自世一堂中藥材有限公司，批號130916，產地黑龍江。PBS磷酸鹽緩沖液(北京博奧拓達科技有限公司，140703)，刀豆蛋白(sigma:C-2010)，改良型RPMI-1640培養基(賽默飛世爾生物化學制品有限公司，NZD1134)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司,140520)，青霉素鏈霉素混合液(北京博奧拓達科技有限公司，20140512)，MTT(sigma:M2128)，二甲基亞砜(天津凱通化學試劑有限公司,20140510)，2，4-二硝基氟苯(成都格雷西亞化學技術有限公司，D16877)，橄欖油(歐麗薇蘭，20140331)，丙酮(天津市化學試劑六廠三分廠,20110620)，印度墨汁(北京博奧拓達科技有限公司，20130718)，環磷酰胺(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司,13121825)。

1．3實驗儀器AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，DL-CJ-1ND醫用型治凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)，MK3酶標儀(Thermo)，CO2孵育箱(Heal Force,HF90),TGL-20M高速臺式冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)，UVmini-1240型紫外分光光度計(日本島津)。

2方法與結果

2．1淫羊藿水煎液對DNFB誘導的小鼠遲發型特異性超敏反應(DTH)的影響

2．1．1動物分組、造模及給藥量取體質量18～22 g昆明小鼠30只，雌雄各半，隨機分為空白組、模型組和給藥組，每組10只，模型和給藥組小鼠腹部皮膚去毛約1 cm ×2 cm區域，然后用微量移液器取1%DNFB(溶于橄欖油∶丙酮=1∶1中)50 μL，均勻滴加于脫毛區致敏，并且于致敏當天開始，給予淫羊藿水煎液208 mg/kg(按2010藥典中臨床生藥量10 g/d計算)，給藥體積為0．1 mL/10 g，空白組給同體積生理鹽水，連續7 d。末次給藥30 min后，用微量移液器取10 μL的1%DNFB，均勻滴加于小鼠右耳前后兩面觸發，造成DTH模型。

2．1．2取材與測定指標 末次給藥24 h后稱體質量，脫頸椎致死，稱量脾臟和胸腺的重量，脾指數=脾重×10/體質量；胸腺指數=胸腺重×10/體質量。分別剪下雙耳，用8 mm打孔器在相同部位打下圓耳片，電子天平稱重，以左、右耳片重量差值作為腫脹度；摘眼球取血，靜置2 h后低溫離心制備血清，elisa法測定血清中的IL-2和IL-4的含量。

抑制率=對照組平均腫脹度—給藥組平均腫脹度/對照組平均腫脹度×100%

2．1．3淫羊藿水煎液對DNFB所致DTH的影響結果見表1。

2．2淫羊藿水煎液分別對正常小鼠和免疫低下小鼠非特異性單核細胞吞噬作用及免疫器官的影響(碳粒廓清法)

2．2．1動物分組、造模與給藥量取體質量18～22 g昆明小鼠40只，隨機分為空白組、模型組、給藥組和模型給藥組，雌雄各半。給藥組每天給予淫羊藿水煎液208 mg/kg，給藥體積為0．1 mL/10g，連續給藥10 d，空白組和模型組給同體積生理鹽水。模型組和模型給藥組于第7～10天，每天灌胃30 min后皮下注射環磷酰胺80 mg/kg，1次/d，注射體積為0．1 mL/10 g。

±s，n=10)

注：與空白組比較，##P<0．01，與模型組比較，△△P<0．01

2．2．2單核細胞吞噬功能的考察[5-6]末次給藥后24 h，按0．1 mL/10 g尾靜脈注射稀釋的印度墨汁(1%明膠稀釋4倍)，于注入墨汁后2、6 min分別從眼靜脈叢取血20 μL，立即加入裝有2 mL的0．1% Na2CO3的試管中，以0．1% Na2CO3溶液做空白對照，于600 nm下測定OD值，帶入下列公式計算廓清指數和吞噬指數，并且脫臼處死后取脾臟和胸腺稱重，按2．1．2中方法測脾指數和胸腺指數。

廓清指數：k=(lgOD1—lgOD2)/(T2—T1)；

吞噬指數：α=K1/3×(體質量/肝重+脾重)

2．2．3淫羊藿水煎液分別對正常小鼠和免疫低下小鼠單核細胞吞噬作用及免疫器官的影響結果見表2。

±s，n=10)

注：與空白組比較，#P<0．05，##P<0．01；與模型組比較，△P<0．05

2．3淫羊藿水煎液對ConA誘導的小鼠體外脾細胞增值的影響

2．3．1小鼠脾淋巴細胞制備將1640培養基、胎牛血清、青霉素鏈霉素液按90∶10∶1比例混合，制成培養基混合液。取健康昆明雄性小鼠1只，禁食禁水12 h后處死，于超凈工作臺中解剖，取脾臟放入平皿中用PBS清洗后，轉移至100目不銹鋼篩網上，用無菌注射器芯擠壓研磨脾組織，并用PBS輕輕沖洗鋼網，制成脾細胞懸液，分裝在兩只10 mL的離心管中，離心后去上清液，分別裝入8 mL的PBS，用移液槍吹打沖洗管壁，再離心去上清液，重復2次后加入培養基混合液反復吹打管壁，配成6×106個/ mL的均勻細胞懸液。

2．3．2給藥濃度確定及細胞毒作用考察在96孔板中，每孔加100 μL的2．4．1中的細胞懸液，設空白孔、模型孔、各濃度給藥孔，藥粉加培養基溶解過膜后配制成8、4、2、1、0．5、0．25、0．125、0．062 5 mg/mL。

2．3．3接種細胞在96孔板中，每孔加100 μL的2．3．1項下的細胞懸液，實驗分為空白組、模型組、各劑量給藥組，每組平行三復組，除空白組外其他各組均加入20 μL濃度為35 mg/mL的ConA，低、中、高給藥組分別加入濃度為0．25、0．5、1 mg/mL的過膜后的淫羊藿水煎液各20 μL，空白組和模型組分別補充培養基混合液至等體積。將96孔板置于37 ℃的CO2孵箱，飽和濕度下培養44 h后，各孔避光加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續培養4 h后2 000 r/min離心，棄上清，加入DMSO溶解液150 μL，30 min后在492 nm下用酶標儀測定各孔的吸光度值，小鼠脾淋巴細胞存活率=樣品孔均值/(空白孔均值×100%)。

2．3．4淫羊藿水煎液對ConA誘導的小鼠體外脾淋巴細胞增值的影響結果見表3。

組 別吸光度值存活率/%空白組0.761±0.026 100模型組1.054±0.024##138.458給藥0.25mg/mL組0.817±0.032△△115.725給藥0.5mg/mL組0.730±0.037△△102.102給藥1mg/mL組0.587±0.035△△93.955

注：與空白組比較，##P<0．01，與模型組比較，△△P<0．01

3討論

免疫器官是免疫細胞分化、發育和成熟的場所，免疫器官的增大與減小很大程度上反映了機體的免疫功能。采用2,4-二硝基氟苯造成非特異性遲發型超敏變態反應模型，造模劑量適中，存活率高，以免疫器官指數為考察指標，模型組與空白組差異明顯，結果表明淫羊藿水煎液對超敏所致的脾指數增加、耳腫脹，血清中炎癥因子IL-2、IL-4含量升高均有顯著的回調作用，提示淫羊藿水煎液對超敏反應的顯著抑制作用可能是通過改變細胞內信息傳導來實現的。

廓清指數是血流中異物被巨噬細胞清除的速率，其廓清指數越大，碳粒廓清能力越強，而碳粒廓清能力又反應單核細胞的吞噬能力，單核細胞的吞噬能力是反映其免疫功能的主要指標之一。本實驗以碳粒廓清法分別考察WDE對正常小鼠和環磷酰胺(CY)造成的免疫低下小鼠的免疫系統的調節作用，CY是較強的烷化劑，可殺傷各種免疫細胞，抑制免疫功能，為免疫學研究中常用造模劑。結果表明淫羊藿水煎液對免疫低下小鼠脾臟萎縮有明顯的拮抗作用，并可促進單核細胞吞噬功能，在這相同廓清法下，淫羊藿水煎液對正常小鼠的脾系數有下調現象，并對單核細胞廓清指數有明顯的降低，這種現象可能是由于淫羊藿在生物免疫應答上存在多水平，多環節的調節功能，其在此模型下表現出來的上調或下調免疫水平的結果，更有力地提示其對免疫系統存在雙向調節作用。

脾淋巴細胞是重要的免疫活性細胞，它能被有絲分裂原ConA所激活向淋巴母細胞轉化，在轉化過程中DNA、RNA及蛋白質合成增加使細胞分裂增殖[7]，采用MTT法考察脾淋巴細胞的增殖程度，可反映機體細胞的免疫功能。Colic M等[8]研究證實，淫羊藿可使之前在體內活化了的淋巴細胞在體外卻表現出免疫抑制活性，這也證明了本實驗中，高、中劑量淫羊藿水煎液使體外脾淋巴細胞轉化增殖能力明顯下降這一結果。

在中藥臨床治療中發現，許多中藥在病理狀態下有很好的療效，但對正常生理狀態條件下所起作用并不明顯，這是由于病理狀態下的藥物吸收速度、吸收部位、轉化后血藥濃度與正常生理狀態有很大不同，機體代謝和應激通路反應等亦存在很大差異。因此構建成功的更接近臨床應用實際情況的病理模型，無疑具有重要的意義。本實驗通過遲發性特異性超敏模型、碳粒廓清法非特異性模型、體外脾淋巴細胞增殖3種模型綜合研究淫羊藿水煎液對小鼠免疫系統的影響,造模方法成熟,結果差異明顯。研究中不僅成功地造成超敏反應和免疫抑制2種病理狀態，而且在碳粒廓清法中分別考察了淫羊藿水煎液對正常小鼠和免疫低下小鼠單核細胞吞噬能力，證明了在正常生理狀態下淫羊藿水煎液是沒有起到免疫增強作用，甚至出現了抑制，但其對正常機體的免疫保護作用是通過拮抗CY誘導的免疫功能下降來體現的,可以用于臨床上化療藥物等易引起免疫功能低下疾病的防治；此外，淫羊藿水煎液對超敏反應小鼠和脾淋巴細胞惡性增殖均有很好的免疫回調和保護作用，不僅對超敏反應下的小鼠免疫器官、耳腫脹，IL-2、IL-4水平有明顯的抑制作用，并且對ConA誘導的脾淋巴細胞增殖有明顯的拮抗作用。綜合分析各模型后不難發現，淫羊藿水煎液對正常小鼠有輕微免疫抑制作用，對超敏反應小鼠有顯著的免疫抑制作用，并對免疫低下小鼠有顯著的免疫增強作用，說明淫羊藿水煎液可能對免疫系統具有雙向調節作用，但其影響機制的分子學基礎尚不十分清楚，有待于進一步對淫羊藿及其提取物進行生物免疫應答方向的研究。

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Interventional effect of water decoction of Epimedium on immune system model of mice at different levels

YANG Xiaoxu,WANG Yu,HAN Zhenai,XUE Di,LIU Shumin*

(Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

Abstract：ObjectiveStudy the comprehensive effect of water decoction of Epimedium(WDE) on immune system of mice by constrcting three immune system model.This study provides the theory basis of clinical treatment for immune system diseases by using traditional Chinese medicine.MethodsThe author investigated the effect of WDE on different immune model by establishing three models.There are delayed type hypersensitivity (DTH) model,normal mice and immunocompromised mice model model evaluated by carbon clearance method,and multiplication of splenic lymphocyte model induced by ConA.ResultsThe coefficient of spleen,IL-2 and IL-4 of hypersensitivity decreased significantly(P<0．01) after giving WDE.Detecting by Carbon clearance method,WDE decreased coefficient of spleen,expurgation index,phagocytic count of normal mice compared with blank group(P<0.05).However,the WDE significant increased coefficient of spleen,expurgation index,phagocytic count of immunocompromised mice compared with model group(P<0.05)which were both given Cy.In addition,WDE can significantly inhibit the spleen lymphocyte proliferation reaction induced by ConA,and its strength are dose dependent.ConclusionThe WDE has the effect of immunosuppression on DTH in mice and normal mice ,and on restrain the malignant proliferation of spleen lymphocytes in vitro,and on enhancing and protecting the immune system in immunocompromised mice obviously.So,the WDE could have two-way adjustment function of the immune system.

Keywords：water decoction of Epimedium(WDE);immune system;regulating effect

(收稿日期:2015-06-11)

文章編號：2095-6258(2016)01-0014-04

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

*通信作者：劉樹民，教授，博士研究生導師，電話-(0451)82193278，電子信箱-kji-liu@163.com

作者簡介：楊曉旭(1987-)，女，博士研究生，主要從事中藥性味理論研究。

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)課題(2013CB531804)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.01.005