不同劑量生白術對慢傳輸型便秘大鼠胃腸道傳輸功能及Cajal間質細胞的影響

王文革，次苗苗，張俊紅，劉　興

(1.中國人民解放軍空軍總醫院兒科，北京100142;2.北京市大興區紅星醫院兒科，北京 100076)

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不同劑量生白術對慢傳輸型便秘大鼠胃腸道傳輸功能及Cajal間質細胞的影響

王文革1，次苗苗1，張俊紅1，劉興2

(1.中國人民解放軍空軍總醫院兒科，北京100142;2.北京市大興區紅星醫院兒科，北京 100076)

摘要：目的比較不同劑量生白術對慢傳輸型便秘大鼠(STC)胃腸道傳輸功能及Cajal間質細胞(ICC)的影響。方法Wistar大鼠40只，分為空白對照組、模型組、常規劑量生白術組、大劑量生白術組。空白對照組及模型組給予生理鹽水灌胃,其余各組均給予相應藥物灌胃治療，14 d后采用營養性半固體糊灌胃法測定各組大鼠胃殘留率、黑色炭末推進率，并采用免疫組化法觀察各組大鼠胃竇、小腸、結腸組織ICC細胞數量及形態的變化。結果常規劑量生白術組、大劑量生白術組與模型組比較，胃殘留率明顯降低(P<0．05)，而二者之間比較無統計學意義(P>0．05)。常規劑量生白術組、大劑量生白術組均可增加黑色炭末推進率(P<0．05)，其中大劑量生白術效果優于常規劑量生白術(P<0．05)。常規劑量生白術組、大劑量生白術組均可增加c-kit陽性細胞的面積(P<0．05),而大劑量生白術優于常規劑量生白術(P<0．05)。結論生白術常規劑量及大劑量均可促進慢傳輸型便秘大鼠的胃動力,而在改善其腸道傳輸功能及增加c-kit陽性細胞面積方面則以大劑量白術效果為佳。

關鍵詞：生白術；慢傳輸型便秘；胃腸動力；Cajal間質細胞

慢傳輸型便秘(slow-transit constipation,STC)是一種以結腸通過時間延長和結腸動力下降為特征的頑固性便秘,是慢性便秘中常見的類型，好發于兒童、婦女和老人，不僅嚴重影響患者的生活質量，還給家庭及社會帶來了沉重的經濟負擔[1-2]。近年來，隨著人們飲食結構、生活習慣以及精神心理等因素的影響，其發病率呈逐年上升趨勢，而臨床對STC的治療一直不能取得滿意療效，目前患者對慢性便秘治療的滿意度低于50%[3-4]。STC治療困難的主要原因是其發病原因不明，發病機制尚不確切。Cajal間質細胞(interstitial cell of Cajal,ICC)是腸神經系統的一種具有獨立功能的特殊類型的細胞,以網狀結構存在于胃腸道[5]。由于其在控制胃腸動力方面獨特和重要的地位,已逐漸成為胃腸動力領域的研究熱點之一。近年來研究[6-7]表明，ICC的數量減少、分布、結構及功能異常，是STC的發病機制中的關鍵因素。白術是傳統的補氣藥，有健脾燥濕之功，常用于脾虛泄瀉，較少專用于通便。而單用大劑量生白術則可治療慢性便秘，近10年來驗之臨床，療效頗佳[8-9]。不同劑量白術為何有不同的臨床療效，其作用機制如何，有待進一步的實驗加以揭示。本實驗采用胃殘留率及黑色炭末推進率測定以檢測大鼠的腸道傳輸功能，研究不同劑量生白術對STC大鼠胃腸道傳輸功能的影響；并采用免疫組化法，觀察白術對STC大鼠胃竇、小腸、結腸組織ICC細胞數量及形態的影響,以期探討不同劑量生白術對STC的作用機制。

1材料

1.1實驗動物健康Wistar大鼠40只，清潔級，均為雄性，周齡4～5周，體質量50～80 g，由斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2011-0004。

1.2主要試劑大黃酸粉(南京澤朗醫藥技術有限公司，批號:ZL20130310A)；生理鹽水(湖南康源制藥有限公司)。粉末活性炭(分析純)(國藥集團化學試劑有限公司)；生白術水煎劑：生白術飲片(北京同仁堂藥店)，將生白術用蒸餾水浸泡12 h后高火煎煮20 min, 倒出煎液，12層紗布過濾，重復2次，合并3次濾液，濃縮為1.75、7.0 g/mL藥液，按生白術臨床治療便秘大劑量60 g/d，常規劑量15 g/d，換算配制水提物溶液。營養性半固體糊的制備[10-11]： 取10 g羧甲基纖維素鈉，溶于250 mL蒸餾水中，分別加入16 g奶粉，8 g糖,8 g淀粉和2 g活性炭末,攪拌均勻，配制成300 mL約300 g的黑色半固體糊狀物，冰箱冷藏,用時恢復至室溫。制備后營養性半固體糊密度為1 g /mL。

1.3主要儀器Termo烤片儀(英國)；RM2235石蠟切片機(德國LEICA公司)；RM2145組織切片機(美國Leica公司)；DH3600 A電熱恒溫培養箱(天津泰斯特儀器有限有限公司) ECLIPSE801生物顯微鏡(日本Nikon公司)；數碼相機(日本Olympus公司)；ANTI-MOULD型顯微鏡攝像系統(日本Nikon公司)。4 ℃冰箱(美菱冰箱廠)；微量可移液器(美國Gilson公司)；c-kit兔抗鼠多克隆抗體(美國 Santa Cruz公司)；兔/鼠兩步法試劑盒(北京中杉生物技術有限公司)。

2方法

2.1STC大鼠模型制備參照張波等[12]的造模方法,采用大黃酸粉懸液灌胃法建立STC大鼠模型。大鼠分籠飼養，保持適宜的環境，飼養7 d后開始建立模型。對照組給予10 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃。各治療組、模型組給予大黃酸粉懸液灌胃，造模過程分3個循環完成。第1循環約35 d，給藥劑量為240 mg/(kg·d)，灌2 d停1 d，灌胃第2天半數大鼠出現稀便，維持此劑量至80%大鼠稀便消失后開始下一循環；第2循環約35 d，給藥劑量同上，灌5 d停2 d，直至80%大鼠稀便消失；第3循環約45 d，給藥劑量為320 mg/(kg·d)，灌5 d停2 d，直至80%大鼠稀便消失；3個循環共約115 d。

2.2動物分組及處理按照完全隨機的方法，將40只大鼠完全隨機分為空白對照組、模型組、常規劑量生白術組、大劑量生白術組，每組10只，分組后各組體質量無顯著性差異。模型建立后，空白對照組、模型組給予10 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃。常規劑量生白術組、大劑量生白術組分別給予生白術水煎劑，1.75、7.0 g/(kg·d)給大鼠灌胃[3-4]，2次/d，共14 d，每天觀察大鼠的精神狀態、皮毛色澤，活動范圍，進食、飲水量及大便性狀。整個過程結束普通干飼料飼養待處理。

2.3觀察指標及方法

2.3.1胃殘留率及黑色炭末推進率測定治療結束7 d后大鼠禁食，不禁水24 h，各組大鼠經口灌入營養性半固體糊2 mL，40 min后以頸椎脫臼法處死，立即剖腹，結扎幽門與賁門和直腸末端，取出全胃，幽門至直腸末段的全部腸管，清洗胃表面，測得胃總重(W1)后，沿胃大彎剖開，洗去胃內容物，用濾紙吸干水分測得胃凈重(W2)，并計算胃殘留率。無張力情況下測量腸道全長(L1)及黑色營養性半固體糊在腸道內推進的長度(L2)，并計算黑色炭末推進長度占腸道全長的百分比，最后計算每組的平均值。胃殘留率(%)=(W1-W2)/糊重×100%。黑色炭末推進率(%)=(L2/ L1)×100%。

2.3.2標本采集胃稱重后，留取胃竇部胃壁全層，約0.5 cm×0.5 cm大小。同時十二指腸遠端、結腸(直、乙狀結腸)各留取長約1 cm的腸管組織，縱行剖開，生理鹽水沖洗，分別固定于多聚甲醛溶液中，常規脫水，石蠟包埋。

2.3.3HE染色片制備和觀察石蠟切片后常規脫蠟脫水，蘇木素染色液中染色5 min，自來水洗，溫水藍化，自來水沖洗，伊紅染色液染色2 min，80%乙醇適當分化，95%、無水乙醇分別脫水2次，二甲苯透明1 min，中性樹膠封片。

2.3.4免疫組化染色石蠟切片經常規脫蠟脫水，PBS沖洗，抗原修復(采用高溫高壓修復時間為100 s)，PBS沖洗，過氧化氫溶液37 ℃孵育10 min，PBS沖洗，滴加適量一抗(1∶00)在37 ℃濕盒內孵育60 min，PBS沖洗，滴加二抗，室溫下孵育40 min，水洗，PBS沖洗，滴加DAB顯色液，清水沖洗，蘇木精染色，中性樹膠封片。

3結果

3.1一般情況造模時間為115 d，造模后，大鼠出現皮毛發紅、無光澤，精神萎靡，活動量減少，進食少，形體消瘦，體質量平均下降約20%，飲水量明顯增多。大部分大鼠在飼喂過程中出現血便，半數大鼠出現血尿，3只大鼠在飼養過程中出現脫肛。經生白術灌胃后，大鼠上述情況有所好轉。

3.2各組大鼠胃殘留率比較見表1。

組 別胃殘留量/g胃殘留率/%空白對照組 0.73±0.1936.30±9.57 模型組 1.47±0.2272.74±8.94#常規劑量白術組0.84±0.1841.75±9.16△大劑量白術組 0.91±0.1945.65±9.31△

注：與空白對照組比較，#P<0．05，與模型組比較△P<0．05

3.3各組大鼠黑色炭末推進率比較見表2。

組 別腸道全長/cm黑色炭末推進長度/cm黑色炭末推進率/%空白對照組 133.07±6.2782.35±6.5861.84±3.05 模型組 135.66±4.3353.23±6.6339.24±4.28# 常規劑量白術組132.07±7.6469.51±8.0052.13±4.37△ 大劑量生白術組135.62±5.8576.90±6.5656.76±5.16△▲

注：與空白對照組比較，#P<0．05，與模型組比較，△P<0．05，與常規劑量白術組比較，▲P<0．05

3.4胃腸道大體形態和蘇木精-伊紅染色觀察模型組大鼠胃黏膜層略薄于空白對照組，治療后2組胃黏膜層均有所改善。模型組大鼠小腸黏膜層絨毛與空白對照組相比明顯變短、減少，經常規劑量生白術組、大劑量生白術組治療后，大鼠小腸絨毛形態有所改善，而大劑量生白術較常規劑量生白術效果更明顯。模型組大鼠小腸黏膜層可見少量淋巴細胞為主的炎細胞浸潤，偶有上皮細胞脫落，但未見明顯潰瘍。結腸可見慢性炎癥，全層均有嗜酸性粒細胞浸潤，以固有層為主，但未見明顯的潰瘍。經常規劑量生白術組、大劑量生白術組治療后，小腸、結腸黏膜層炎細胞均有減少。模型組大鼠結腸較空白對照組粗大、迂曲，腸腔內可見大塊糞便存留。經常規劑量及大劑量生白術治療后，結腸腸腔內均未見大塊糞便存留，而大劑量白術組效果更為明顯。

3.5各組大鼠胃腸道中c-kit陽性細胞分布變化比較見表3。

組 別胃小腸結腸空白對照組 35882.00±6519.1042780.43±3819.76 44169.71±5353.43 模型組 33631.57±4473.5318683.86±3431.47#16305.86±5454.73# 常規劑量白術組34035.82±2729.0720542.19±5218.42 25416.57±4621.28△ 大劑量生白術組33998.26±4375.3121067.81±5265.07 32980.11±4019.01△▲

注：與空白對照組比較，#P<0．05;與模型組比較，△P<0．05;與常規劑量白術組比較，▲P<0．05

4討論

白術性溫，歸脾、胃經，其功能主要在于健脾益氣，燥濕利水，用于脾虛食少，腹脹泄瀉。臨床較少專用之治療便秘。1978年北京醫院的魏龍驟[13]先生首先介紹了重用生白術治便秘的臨床經驗，之后的30余年來，大劑量生白術治療便秘已在臨床廣泛使用,且療效肯定。但對不同劑量白術治療便秘的作用機制有何不同，其量效關系如何，相關的實驗研究還較少。

臨床上慢傳輸型便秘患者除便秘之外，往往還有脾虛氣虧之表現，如腹脹、納差、乏力等。根據慢傳輸型便秘的臨床表現，筆者認為其可歸屬于中醫虛秘、氣秘范疇。腸道傳輸緩慢即脾胃運化傳輸能力減弱，故其病位雖在大腸，但與脾虛氣虧有著密切關系。本實驗顯示STC大鼠在黑色炭末推進率明顯降低的同時，其胃殘留率明顯增加，經常規劑量及大劑量白術治療后胃殘留率均有所下降，而二者之間無顯著差異。對于黑色炭末推進率的降低，小腸黏膜層絨毛的改善、結腸腸腔內糞塊的排出以及結腸c-kit陽性細胞的面積增加等方面，大劑量生白術的療效均明顯優于常規劑量生白術。說明生白術常規劑量及大劑量均可以促進STC大鼠的胃動力，而在改善STC大鼠腸道傳輸功能及增加c-kit陽性細胞面積方面則以大劑量白術效果為佳。

作為胃腸道的起搏細胞,Cajal間質細胞(ICC)在控制胃腸道運動中起重要作用，目前公認其在結腸中的數量和結構異常與STC發病有密切的關系。Cajal間質細胞(ICC)的標記方法有多種，而特異性最強的是c-kit。c-kit信號在維持ICC的發育、發展、功能方面具有重要作用，去除大鼠小腸c-kit基因后，ICC將不能產生慢波，從而導致胃腸運動功能紊亂[14]，因此現在常用c-kit免疫組織化學法特異性地檢測ICC[15]，利用c-kit免疫組織化學法可在光鏡水平觀察ICC形態、數量和分布特點[16]。本實驗表明STC大鼠胃竇、小腸、結腸c-kit陽性細胞數目無明顯變化，其胃竇肌層c-kit陽性細胞面積也無明顯變化，而STC大鼠小腸、結腸組織c-kit陽性細胞的面積則明顯降低，其更深層次的機制，還需要進一步的實驗加以闡明。

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AtractylodesmacrocephalaKoidzon gastrointestinal trace and ICC in rat with slow transit constipation

WANG Wenge1,CI Miaomiao1,ZHANG Junhong1,LIU Xing2

(1.Department of Pediatrics,Air Force General Hospital of People’s Liberation Army,Beijing 100142,China;2.Department of Pediatrics,Hongxing Hospital of Daxing District,Beijing 100076,China)

Abstract：Objective To observe the influence of Atractylodes macrocephala Koidz on gastrointestinal trace and ICC in rat with slow transit constipation.MethodsThe 40 Wistar rats were randomly divided into blank control group,model group,Atractylodes macrocephala Koidz normal-dose group,Atractylodes macrocephala Koidz high-dose group.The blank control and model group were given normal saline by gavage,the rest of the groups were given drug treatment accordingly.After 14 days,gastric motility and transit functions of intestinal movement were examined by administering intragastricly of semi-solid nutrition paste.The ICC changes in terms of the number and volume were observed by immunohistochemical method.ResultsAtractylodes macrocephala Koidz treatment group compared with model group can significantly reduce the gastric residual rate ( P< 0．05),but there was no significant difference with each other(P>0．05).Atractylodes macrocephala Koidz normal-dose and high-dose group can increase the carbon black transit rate (P< 0．05),and Atractylodes macrocephala Koidz high-dose group were significantly higher than in the Atractylodes macrocephala Koidz normal-dose t group( P< 0．05).After treatment by Atractylodes macrocephala Koidz, the volume of c-kit positive cell in colon were increased(P< 0．05),and Atractylodes macrocephala Koidz high-dose group was more larger than the Atractylodes macrocephala Koidz normal-dose group(P< 0．05).ConclusionThe Atractylodes macrocephala Koidz normal-dose and high-dose group can promote the gastrointestinal motility,Atractylodes macrocephala Koidz of high-dose has the better effect on transit function of intestinal movement and the volume recovery of ICC in colon.

Keywords：Atractylodes macrocephala Koidz;slow transit constipation;gastrointestinal motility;interstitial cell of Cajal

(收稿日期:2015-06-11)

文章編號：2095-6258(2016)01-0018-04

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

作者簡介:王文革(1966-)，女，博士研究生，副主任醫師，主要從事中西醫結合兒科疾病研究。

基金項目:北京市自然科學基金項目(7122180)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.01.006