鷹嘴豆中3種異黃酮及其溴乙基化衍生物與胰島素體外協(xié)同降糖活性研究

時曉娟,李朋收,魏　穎,李　博,王東超,徐暾海*,劉銅華

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029；2.中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)北京市重點實驗室，北京 100029；

3.中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)教育部重點實驗室，北京 100029)

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·方藥研究·

鷹嘴豆中3種異黃酮及其溴乙基化衍生物與胰島素體外協(xié)同降糖活性研究

時曉娟1,2,3,李朋收1,2,3,魏穎1,2,3,李博1,2,3,王東超1,2,3,徐暾海1,2,3*,劉銅華2,3

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029；2.中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)北京市重點實驗室，北京 100029；

3.中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)教育部重點實驗室，北京 100029)

摘要：目的通過對鷹嘴豆中3種異黃酮類化合物染料木素、鷹嘴豆芽素A、刺芒柄花素進行溴乙氧基化結(jié)構(gòu)修飾，研究其對正常HepG2細胞糖消耗及胰島素抵抗HepG2細胞糖消耗的影響及與胰島素的協(xié)同作用。方法對3種異黃酮類化合物進行溴乙氧基化結(jié)構(gòu)修飾，檢測其對正常HepG2細胞糖消耗的影響；建立HepG2細胞胰島素抵抗模型作為降糖活性篩選模型，研究衍生物降糖活性，并給予生理胰島素濃度以研究其之間存在的協(xié)同作用。結(jié)果合成了4個溴乙氧基化衍生物，其中化合物b具有較好的降糖活性，與陽性藥鹽酸二甲雙胍相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),母體化合物及衍生物與胰島素均存在協(xié)同作用，可明顯增加化合物的降糖活性。結(jié)論通過溴乙氧基化，獲得了降糖活性較好的異黃酮類衍生物，并且可以與胰島素產(chǎn)生協(xié)同作用，為基于中藥的創(chuàng)新型降糖藥物的研發(fā)提供了一定的參考和借鑒。

關(guān)鍵詞：鷹嘴豆；異黃酮類化合物；結(jié)構(gòu)修飾；HepG2細胞；降糖活性

鷹嘴豆(CiceraretinumL.)為豆科(Leguminosae)鷹嘴豆屬(Cicer)植物，為維吾爾族習(xí)用藥材,維吾爾族名為奴乎特、諾胡提，因種子形如鷹頭、雞頭或山狀突起而得名。味甘、性平、無毒，有補中益氣、溫腎壯陽、主消渴、解血毒、潤肺止咳等作用。現(xiàn)代研究[1-7]主要集中在鷹嘴豆有效部位的降血糖作用的研究方面，對單一有效化合物的報道很少。本研究通過對鷹嘴豆中異黃酮類化合物染料木素、鷹嘴豆芽素A、芒柄花素進行結(jié)構(gòu)修飾，并對其降糖活性和與胰島素協(xié)同作用進行了研究，取得了較好的結(jié)果。報道如下。

1儀器與材料

1.1儀器DF-101s集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；R200D型分析天平：德國賽多利斯集團；靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜儀：美國賽默飛世爾科技公司；Bruker Avance DRX-500型超導(dǎo)核磁共振儀：德國布魯克；HERA cell 150i CO2孵育箱：美國Thermo scientific公司；HDL型超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；IX71倒置顯微鏡：日本Olympus公司；Glomax multi酶標儀：美國promega公司；Sigma臺式高速低溫冷凍離心機：Sigma-Aldrich公司。

1.2材料染料木素、鷹嘴豆芽素A、刺芒柄花素購自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司(批號依次為20140901、20140905、20140909，純度≥98%)。人肝癌細胞株HepG2，為北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院保存細胞株。DMEM高糖培養(yǎng)基：美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素混合液：biotopped；胎牛血清：美國ORIGIN公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)：biotopped；胰島素：諾和靈R；鹽酸二甲雙胍：中美上海施貴寶制藥有限公司；胰蛋白酶-EDTA溶液：biotopped；葡萄糖檢測試劑盒：北京普利萊基因技術(shù)有限公司；CCK-8：同仁化學(xué)；細胞培養(yǎng)瓶：Fisher scientific公司。

2方法

2.1目標化合物的合成以染料木素為例，將染料木素2.0 g(7.4 mmoL)溶于100 mL無水乙醇中，加入1,2-二溴乙烷6.8 mL(80 mmoL)和無水碳酸鉀2.0g(14.4 mmoL)，攪拌，回流24 h，趁熱濾除不溶物，濾液減壓濃縮，殘余物用硅膠柱層析進行分離(洗脫條件∶石油醚∶乙酸乙酯=3∶1)，其他化合物合成方法同上。

2.2細胞實驗

2.2.1 HepG2細胞的培養(yǎng)HepG2細胞復(fù)蘇后用4.5 g/L DMEM高糖培養(yǎng)液(含10%滅活胎牛血清)轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中，于細胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5.0%CO2)中培養(yǎng)。當細胞貼壁長滿后，棄去培養(yǎng)液，用PBS溶液輕輕洗滌2次，用0.25%胰蛋白酶消化，每3 d按1∶3比例傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

2.2.2HepG2細胞葡萄糖消耗實驗將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞消化后，用含血清的高糖培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為5×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL細胞懸液。待細胞單層貼壁后，用無胎牛血清的培養(yǎng)基溶解樣品成不同的濃度，每個濃度3個復(fù)孔。實驗設(shè)為空白對照組、二甲雙胍組(終劑量為10-3mol/L)、不同濃度給藥組(終劑量分別為1 000、500、100、10、1 μg/mL)，孵育24 h后，用葡萄糖測定試劑盒(配制成校準液)檢測培養(yǎng)基上清的葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量(GC)，計算公式如下:葡萄糖含量(mmol/L)=(各組吸光度/校準液吸光度)×校準液濃度，葡萄糖消耗量(GC)=未接種細胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量—各組細胞上清液中葡萄糖含量[8]。

2.2.3胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗實驗將處于對數(shù)生長期的細胞消化后，同上法將細胞接種到96孔板中，待細胞單層貼壁后，更換含有胰島素濃度為5×10-7mol/L的DMEM高糖培養(yǎng)液，于細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，以建立高胰島素抵抗細胞模型[9]。實驗設(shè)空白對照組、陽性藥組即二甲雙胍組(終劑量為10-3mol/L)、不同濃度給藥組(終劑量分別為1 000、500、100、10、1 μg/mL)。棄去培養(yǎng)液,給藥組加入不含血清且不同濃度的含藥培養(yǎng)基，空白對照組則加入不含血清的培養(yǎng)基。各組均包括生理胰島素組與不含生理胰島素組。于細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，用葡萄糖測定試劑盒檢測培養(yǎng)上清液中的葡萄糖含量，計算各組細胞的葡萄糖消耗量。

2.2.4CCK-8實驗葡萄糖消耗實驗結(jié)束后，每孔加入10 μ Lcck8，放入37 ℃恒溫箱中，反應(yīng)1 h后取出置于酶標儀中檢測，波長設(shè)定為450 nm，測定吸光度值，記錄數(shù)值并進行相應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)分析。

3結(jié)果與分析

3.1目標化合物的理化常數(shù)及波譜數(shù)據(jù)化合物a 收率35.3%，m.p. 245～246 ℃，為白色粉末狀固體。ESI-MS給出483[M-1]-,示分子量為484。1H-NMR(500 MHz,DMSO)δ 12.94(s,1H,5-OH),8.50(s,1H,H-2),7.54(d,J=7.7 Hz,2H,H-2’,6’),7.05(d,J=7.8 Hz,2H,H-3’,5’),6.73(s,1H,H-8),6.46(s,1H,H-6),4.23(t,J=6.3 Hz,4H,-OCH2-),1.64(dd,J=13.7,6.8 Hz,4H,-CH2Br).13C-NMR(126 MHz,DMSO)δ 180.78(s,C-4),164.30(s,C-7),162.29(s,C-4’),158.35(s,C-5),157.95(s,C-9),155.42(s,C-2),130.75(s,C-2’,5’),123.73(s,C-1’),122.60(s,C-3),114.93(s,C-3’,5’),106.16(s,C-10),98.98(s,C-6),93.61(s,C-8),69.02(s,-OCH2-),68.27(s,-OCH2-),19.13(s,-CH2Br),14.04(s,BrCH2-)。

化合物b 收率 25.2%，m.p. 259～ 260 ℃，為白色粉末狀固體。ESI-MS給出376[M-1]-示分子量為377。1H-NMR(500 MHz,DMSO)δ 12.92(s,1H,5-OH),9.72(s,1H,4’-OH),8.48(s,1H,H-2),7.52(d,J=7.7 Hz,2H,H-2’,6’),7.03(d,J=7.8 Hz,2H,H-3’,5’),6.71(s,1H,H-8),6.43(s,1H,H-6),4.21(t,J=6.4 Hz,2H,-OCH2-),1.61(dd,J=13.7,6.8 Hz,2H,-CH2Br).13C-NMR(126 MHz,DMSO)δ 180.73(s,C-4),162.31(s,C-7),161.21(s,C-4’),157.31(s,C-5),156.91(s,C-9),153.21(s,C-2),130.89(s,C-2’,5’),122.89(s,C-1’),122.44(s,C-3),113.91(s,C-3’,5’),105.11(s,C-10),98.43(s,C-6),93.62(s,C-8),68.27(s,-OCH2-),19.13(s,-CH2Br)。

化合物c 收率42.2%，m.p. 183～184 ℃，為淺黃色粉末狀固體。ESI-MS給出390[M-1]-,示分子量為391。1H-NMR(500 MHz,DMSO)δ 13.05(s,1H,5-OH),8.42(s,1H,H-2),7.52(d,J=7.8 Hz,2H,H-2’,6’),7.123(d,J=7.6 Hz,2H,H-3’,5’),6.45(s,1H,H-8),6.31(s,1H,H-6),4.21(t,J=6.3 Hz,2H,-OCH2-),3.83(s,3H,-OCH3),1.75-1.70(m,2H,-CH2Br).13C-NMR(126 MHz,DMSO)δ 180.37(s,C-4),164.88(s,C-7),162.86(s,C-4’),159.72(s,C-5),158.89(s,C-9),154.21(s,C-2),130.89(s,C-2’,6’),123.77(s,C-1’),122.75(s,c-3),114.43(s,C-3’,5’),105.89(s,C-10),100.89(s,C-6),94.98(s,c-8),61.28(s,-OCH2-),55.34(s,-OCH3),19.97(s,-CH2Br)。

化合物d 產(chǎn)率55.3%，m.p. 179～180℃，為白色粉末狀固體。ESI-MS給出374[M-1]-示分子量為375。1H-NMR(500 MHz,DMSO)δ 8.46(s,1H,H-2),8.06(d,J=8.7 Hz,1H,H-5),7.54(d,J=7.5 Hz,2H,H-2’,6’),7.23(s,1H,H-8),7.13(d,J=8.9 Hz,1H,H-6),7.01(d,J=7.6 Hz,2H,H-3’,5’),4.23(t,J=6.2 Hz,2H,-OCH2-),3.80(s,3H,-OCH3),1.68-1.60(m,2H,-CH2Br).13C-NMR(126 MHz,DMSO)δ 175.09(s,C-4),162.72(s,C-7),159.49(s,C-4’),157.81(s,C-9),154.07(s,C-2),130.56(s,C-2’,6’),127.58(s,C-5),124.48(s,C-1’),123.87(s,C-3),118.38(s,C-6),115.49(s,C-8),114.10(s,C-3’,5’),101.90(s,C-10),65.50(s,-OCH2-),55.62(s,-OCH3),19.35(s,-CH2Br)。

3.2各化合物對HepG2細胞葡萄糖消耗的影響見表1。

3.3各化合物對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗的影響見表2。

4結(jié)論

HepG2細胞系一種表型與肝細胞極為相似的肝胚胎瘤細胞株，其表面含有高親和力的胰島素受體，能夠滿足典型胰島素受體的要求[10-14]。HepG2細胞葡萄糖消耗試驗，一般用來初步考察給試藥物的降糖活性；而胰島素抵抗細胞模型的建立則利于深入研究藥物降糖作用機制。整體來說，本研究中各化合物對胰島素抵抗HepG2細胞糖消耗的促進作用更為明顯。具體表現(xiàn)為，在藥物濃度為1 000、500 μg/mL時，化合物b對胰島素抵抗細胞糖消耗有明顯促進作用，與陽性組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；化合物b對正常HepG2細胞糖消耗的促進作用并不明顯,與陽性組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。從構(gòu)效關(guān)系來看，此類異黃酮母核中，4’-OH為一個主要的降糖活性基團。另外，加入生理胰島素，各組藥物對胰島素抵抗HepG2細胞的葡萄糖消耗均為增加的趨勢，表明藥物與胰島素具有協(xié)同降糖活性。同時，藥物對細胞增殖無顯著影響，提示化合物促進正常HepG2細胞及胰島素抵抗細胞的糖消耗并非通過增加細胞數(shù)量來實現(xiàn)。本研究表明，染料木素通過溴乙氧基化修飾后，降糖活性大大提高，且能夠與胰島素產(chǎn)生協(xié)同作用，可為胰島素輔助藥物的研究與開發(fā)提供參考和借鑒。

±s)

注：與鹽酸二甲雙胍組比較，#P<0.05，##P<0.01

±s)

續(xù)表

組 別培養(yǎng)條件藥物/(μg/mL)加入生理胰島素/(U/mL)CCK-8(A450)GC/(mmol/L)GC/CCK-8/(mmol/L) 100—1.180±0.0062.341±0.2481.985±0.213# 1000.0011.179±0.0044.881±0.1944.141±0.190 10—1.173±0.0021.746±0.2751.488±0.236## 100.0011.179±0.0044.921±0.1124.172±0.103 1—1.176±0.0041.548±0.1191.316±0.097## 10.0011.176±0.0054.643±0.0973.949±0.099 化合物c組 1000—1.177±0.0041.587±0.3001.349±0.258## 10000.0011.176±0.0043.056±0.0692.598±0.067 500—1.179±0.0071.548±0.2061.313±0.183 5000.0011.180±0.0072.937±0.0692.488±0.069 100—1.176±0.0051.508±0.3831.283±0.330 1000.0011.183±0.0022.976±0.1192.516±0.100 10—1.184±0.0021.429±0.2381.206±0.203 100.0011.178±0.0072.937±0.1372.492±0.118 1—1.183±0.0011.389±0.1821.174±0.154 10.0011.184±0.0052.778±0.1822.346±0.145 化合物d組 1000—1.174±0.0011.825±0.1371.555±0.119## 10000.0011.182±0.0013.056±0.0692.585±0.056 500—1.180±0.0061.587±0.0691.345±0.056 5000.0011.179±0.0062.857±0.1192.423±0.110 100—1.181±0.0021.508±0.1821.277±0.152 1000.0011.184±0.0012.817±0.0692.380±0.056 10—1.179±0.0051.429±0.1191.212±0.101 100.0011.180±0.0032.897±0.3442.455±0.295 1—1.179±0.0051.389±0.2481.178±0.215 10.0011.185±0.0032.817±0.1822.378±0.153

注：與鹽酸二甲雙胍比較，#P<0.05，##P<0.01；與染料木素最大給藥劑量組比較，△P<0.05

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Synergistic hypoglycemic activity in vitro of three kinds of isoflavone in chickpea and its bromine ethoxylated structure modification and insulin

SHI Xiaojuan1,2,3,LI Pengshou1,2,3,WEI Ying1,2,3,LI Bo1,2,3,WANG Dongchao1,2,3,XU Tunhai1,2,3*,LIU Tonghua2,3

(1.School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.Beijing Key Laboratory of Health-cultivation,Beijing 100029,China;3.Health-cultivation Laboratory,Ministry of Education,Beijing 100029,China)

Abstract：ObjectiveThrough the bromine ethoxylated structure modification of three isoflavones which was genistein,biochanin A,formononetin in chickpea,we studied the influence of glucose consumption of HepG2 cell and insulin-resistance of HepG2 cell and the synergistic effect with insulin.MethodsThe three kinds of isoflavones were modified by the bromine ethoxylated structure modification,and the effect of the glucose consumption of normal HepG2 cell was detected.We established the insulin-resistance of HepG2 cell as a screening model for hypoglycemic activity,and studied the hypoglycemic activity of these derivatives,and given the physiological insulin concentration to study the synergistic effect between them.ResultsFour derivatives of bromine ethoxylated derivatives were synthesized,and the compound B had good hypoglycemic activity,and the difference was not statistically significant (P>0.05) compared with the positive drug metformin hydrochloride.The parent compounds and its derivatives had synergistic effect with the insulin,and could increase the activity of the hypoglycemic activity of the compounds obviously.ConclusionThe isoflavone derivatives with good hypoglycemic activity were obtained by the bromine ethoxylated structure modification,and it can be synergistic with insulin.It would provide reference for the research and development of innovative hypoglycemic agents based on traditional Chinese medicine.

Keywords：chickpea;isoflavone;structure modification;HepG2 cell;hypoglycemic activity

(收稿日期:2015-06-26)

文章編號：2095-6258(2016)01-0028-06

中圖分類號：R284.3

文獻標志碼：A

*通信作者：徐暾海，教授，博士研究生導(dǎo)師，電話-(010)64286935，電子信箱-hxu@yahoo.com

作者簡介：時曉娟(1990-)，女，碩士研究生，主要從事中藥降糖活性成分研究。

基金項目：科學(xué)技術(shù)部國家國際科技合作項目“中醫(yī)藥干預(yù)治療胰島素抵抗創(chuàng)新中藥研究”(2010DFB33260)；北京市教育委員會共建項目“中藥干預(yù)胰島素抵抗技術(shù)平臺建設(shè)與方藥篩選研究”(2011)；北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團隊項目(2011-CXTD-19)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.01.009