誘導痰技術及在支氣管哮喘中的應用

肖 偉 綜述，劉躍建，龍懷聰 審校

(1.西南醫科大學，四川 瀘州 646000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院 a.呼吸科，b.老年科，四川 成都 610072)

誘導痰技術及在支氣管哮喘中的應用

肖 偉1綜述，劉躍建2a，龍懷聰2b審校

(1.西南醫科大學，四川 瀘州 646000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院 a.呼吸科，b.老年科，四川 成都 610072)

近10年來，誘導痰技術在醫學研究中得到了日益廣泛的應用，也為呼吸系統疾病提供了一種簡便、無創、安全的檢查方法。本文綜述了誘導痰技術的方法、誘導痰細胞及液相成份在哮喘研究及臨床中的應用。

誘導痰；哮喘；生物標志物；臨床應用

誘導痰技術始于1958年，最初是用于診斷肺癌，后來逐漸應用于肺結核、卡氏肺孢子蟲肺炎等呼吸道感染性疾病的診斷。1992年Pin等為研究支氣管哮喘(簡稱哮喘)第一次通過改良的方法獲得誘導痰。近年來大家對這種通過非侵入性手段獲得呼吸道疾病生物標記物的方法，表現出越來越濃厚的興趣。誘導痰的細胞成分(如嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞)、蛋白質成分(例如粘蛋白和細胞因子)和微生物組分(如病毒和細菌)可以被用作疾病的嚴重性、急性發作、臨床進展以及治療效果評價的標志物[1，2]。近年來，誘導痰技術作為呼吸道疾病(如哮喘和慢性阻塞性肺疾病)檢查的一種手段，正因其無創性、安全性及可重復性越來越受到大家重視。以下就對誘導痰技術及其在哮喘中的應用做一綜述，以便大家對其有更加深入的了解。

1 誘導痰的方法

1.1 誘導痰的收集 誘導痰技術是以高滲鹽水霧化吸入誘導無痰或少痰患者產生足量痰液，以便對下氣道分泌物中的細胞及其他液相成分進行分析研究的一種無創的檢測方法。目前常用的誘導方法有兩種：①在固定的時間段霧化吸入相同濃度或漸增濃度的高滲鹽水。②吸入高滲鹽水(4.5%)的濃度不變，逐漸增長吸入時間。誘導方法的選擇對痰細胞成分與計數幾乎不影響，但痰誘導的持續時間必須保持一致，因為它可能會影響痰中的細胞成分及計數。早期的痰樣品中含有更多的粒細胞和單核細胞。誘導痰的時間一般控制在10～20分鐘為宜。

不論使用哪種誘導技術，均不是絕對安全的。高滲鹽水可引起哮喘患者氣道的嚴重收縮，誘發哮喘發作。因此在操作開始前讓患者吸入短效β2受體激動劑，以降低患者對痰誘導的不耐受及危險性。目前已經證實，同一哮喘患者行或不行沙丁胺醇預處理，對誘導痰的細胞成分及計數均無影響[3]。此外，哮喘患者使用支氣管擴張劑后一秒用力呼氣容積(Forced expiratory volume in one second，FEV1)<65%預測值，建議使用等滲鹽水代替高滲鹽水。使用高滲或等滲鹽水不改變誘導痰的細胞或生化讀數[4]。對于缺乏經驗的實驗室，歐洲呼吸學會Task Force小組推薦的步驟可作為操作的指導。

1.2 痰液的處理 獲得痰標本后，應在2小時內進行處理，以減少細胞成分及細胞計數的偏差。然而，放置在冰箱中的樣品，在4 ℃下保存，待測時間可適當延長，不會影響細胞學檢測，但存放時間不宜超過24小時[5]。目前有兩種痰處理方法。第一種方法，選擇痰液中黏稠部分。第二種方法是不經選擇，將整個痰液及唾液進行處理。將樣品放入預稱重的聚苯乙烯管中并稱重。不經選擇的樣本加入等體積的二硫蘇糖醇(DTT)或經選擇的樣本加入4倍體積DTT。這是兩種方法的不同之處，后續步驟完全一致。DTT打破了粘蛋白分子的二硫鍵，使細胞分散。用吸管反復吹打樣品，然后在渦流混合器中攪拌30秒鐘，在37 ℃振蕩水浴中振蕩10～30分鐘。通過48微米尼龍網過濾，濾除粘液和碎屑。過濾后懸液以2000 r/min轉速，離心5分鐘，以便細胞從上清液中分離。上清液可儲存在-70 ℃冰箱中，以備后用。將1%小牛血清PBS緩沖液加入離心沉渣中，使其體積等于離心前。用臺盼蘭排染法測定細胞活力，計數細胞總數。剩余的細胞混懸液加入細胞涂片離心機中制片并以姬姆薩染色。至少計數400非鱗狀上皮細胞，并報告為巨噬細胞、嗜中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和支氣管上皮細胞的相對數量，表示為總的非鱗狀細胞的百分比。鱗狀細胞的百分比應單獨報告。對兩種取痰方法的對比發現選取法優于全選法[6]。

2 誘導痰是研究哮喘的一種重要工具

2.1 誘導痰細胞學 健康受試者誘導痰細胞成分以巨噬細胞[非吸煙組(62.74±12.85)%，吸煙組(57.73±14.37)%]和中性粒細胞[非吸煙組(29.53±18.87)%，吸煙組(39.94±18.52)%]為主，嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、支氣管上皮細胞數量較少[7]。哮喘患者和健康受試者相比誘導痰的細胞成分有明顯不同。與健康受試者相比，哮喘患者痰中所含的嗜酸性粒細胞數量更多。非類固醇治療的哮喘患者痰嗜酸性粒細胞比例為0～75%，近一半哮喘患者誘導痰中嗜酸性粒細胞>5%，約17%的哮喘患者誘導痰中嗜酸性粒細胞比例超過20%。相反，在未治療的輕度到中度哮喘患者中有31%的患者痰液中嗜酸性粒細胞未見顯著升高(>2%)[8]。這個結果與肺活檢及支氣管肺泡灌洗的結果相一致。嗜酸性粒細胞的聚集與激活直接引起氣道炎癥，在哮喘的發病過程中起著重要作用。雖然痰中嗜酸性粒細胞增多是哮喘的典型特征，但并非所有哮喘患者的誘導痰均相似的細胞分布。在有25%未治療的成人哮喘及50%糖皮質激素治療的成人哮喘患者誘導痰嗜酸性粒細胞計數在正常范圍[9]。在這些非嗜酸性哮喘患者中有一部分患者痰中中性粒細胞明顯升高，特別是哮喘急性發作者。因此，根據誘導痰細胞相對數的不同，哮喘可被分為四種表型：嗜酸性哮喘(嗜酸性粒細胞比例>2%)，嗜中性粒細胞性哮喘(嗜中性粒細胞比例>61%)，混合粒細胞性哮喘(中性粒細胞比例>60%和嗜酸性粒細胞比例>2%)和粒細胞缺乏性哮喘(各種細胞相對數均在正常范圍內)[10]。

與粒細胞不同，淋巴細胞的比例相對較少約為1%～2%，很少超過5%。雖然痰中淋巴細胞比例較低，但通過流式細胞術對痰細胞進行詳細的分析表明，哮喘患者CD4+T淋巴細胞和表達CD54受體(ICAM-1)的T淋巴細胞的比例增加，而NK細胞比率降低[11]。該研究結果與哮喘的氣道炎癥由活化的CD4+T細胞調控的概念相一致。哮喘的發生主要是因其機體免疫耐受功能受損，而活化的CD4+T細胞在機體免疫耐受中起著重要的調節作用。

2.2 流體相的生化標志物 誘導痰上清液可測定多種生化標志物。嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP)和類胰蛋白酶，作為嗜酸性粒細胞和肥大細胞的活化標志物，均能在哮喘患者誘導痰上清液中提取出，且明顯高于健康者，這進一步證實嗜酸性粒細胞增多是哮喘的特征之一[12]。嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP)也可以作為哮喘嚴重程度的一個臨床指標，且ECP比嗜酸性粒細胞計數與肺功能更具有相關性[13]。哮喘的另一個基本特征是氣道重構。可溶性重構相關蛋白，如膠原蛋白的合成肽、基質金屬蛋白酶(MMPs)、基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)和細胞因子，也可在痰上清液檢測[14]。誘導痰中還可以檢測到多種生長因子，血管內皮生長因子(VEGF)是其中一種，該VEGF及其受體的表達與氣道炎癥及氣道重構具有密切關系。增高的VEGF表達與嗜酸性粒細胞表型哮喘、氣流受限及哮喘的嚴重程度相關聯，從而為預防和治療嚴重哮喘提供幫助[15]。

3 誘導痰技術在臨床實踐中的應用及前景

繼非特異性支氣管高反應性的測定后，痰嗜酸性粒細胞的檢測成為診斷哮喘最有效的檢查方法。通過測定痰中嗜酸性粒細胞的數量可對哮喘患者吸入糖皮質激素的療效進行預測。研究顯示：嗜酸性粒細胞性哮喘對激素的治療反應性明顯高于中性粒細胞性哮喘[16]。痰嗜酸性粒細胞增多與吸入激素后臨床癥狀改善程度正相關。研究表明：基于痰嗜酸粒細胞的哮喘的治療能有效地減少哮喘惡化及復發[2]；然而，基于FeNO水平的哮喘治療，在改善兒童和成人哮喘結果中，并未被證明有效[17]。這可能對臨床醫師在不久的將來治療哮喘的策略產生影響，因為這將意味著部分哮喘患者將不能從吸入糖皮質激素治療中獲益。

此外，痰嗜酸性粒細胞也可作為預測哮喘復發的一個指標，Giannini等的研究顯示痰嗜酸性粒細胞比例對哮喘癥狀復發的陽性預測值為71%，而陰性預測值為84%[18]。痰嗜酸性粒細胞計數可以作為氣道炎癥極好的生物標志物，也可以作為疾病嚴重程度的標記物。此外痰嗜酸性粒細胞計數(%)也可用于預測哮喘的控制狀態[19，20]。并且，痰嗜酸性粒細胞的檢測值比另一個哮喘氣道炎癥的非侵入性標記物NO水平更有意義。

4 總結與展望

近年來誘導痰分析已成為研究呼吸系統疾病氣道炎癥評估的非侵入性的方法。因誘導痰技術的安全性、無創性、良好的耐受性為該技術的推廣奠定了基礎。目前，該方法已得到標準化，從而明顯提高痰標本的質量及可重復性。但由于誘導痰技術的操作時間及費用問題，限制了其在臨床中的廣泛應用。更重要的是，雖然誘導痰細胞分析的短期重復性似乎是不錯的[21]，但炎性表型不穩定，并且可以自發或隨治療的改變而變化，單一的誘導痰檢查不能可靠地預測持續性氣道炎癥表型[22]。

盡管如此，誘導痰技術仍然值得推廣。它不僅可以在氣道炎癥性疾病如哮喘、慢性阻塞性肺疾病及慢性咳嗽等的診斷、病情評估、疾病監測以及治療選擇中起到重要作用，亦可為肺結核、呼吸系統腫瘤的診斷提供一種安全且耐受性良好的檢查手段，為疾病的診斷提供依據[23～24]。

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Induced sputum technique and its application in asthma

XIAO wei1，LIU Yue-jian2a，LONG Huai-chong2b

四川省科技廳科研基金資助項目(編號：2012JY0056)

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2015-12-08；

2016-01-24)