TRPC6基因突變致局灶節段性腎小球硬化的研究進展

彭 梅，李貴森

(1.遵義醫學院，貴州 遵義 563000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院腎臟內科暨腎臟病研究所，四川 成都 610072)

TRPC6基因突變致局灶節段性腎小球硬化的研究進展

彭 梅1，2，李貴森2△

(1.遵義醫學院，貴州 遵義 563000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院腎臟內科暨腎臟病研究所，四川 成都 610072)

局灶節段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)是激素耐藥型腎病綜合征的主要病因，發病機制十分復雜。關鍵的足細胞結構蛋白基因突變常常導致遺傳性FSGS，如裂孔隔膜(SD)的瞬時受體電位陽離子通道蛋白6(TRPC6)即為其中之一。TRPC6基因突變可以導致細胞鈣內流增加促使FSGS 的發生。現就TRPC6基因突變致FSGS發病機制的研究進展作一綜述。

局灶節段性腎小球硬化；TRPC6；突變；發病機制

局灶節段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)是腎病綜合征常見的原因之一，也是導致激素抵抗型腎病綜合征主要病因之一，預后較差，可迅速進展為終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)[1～3]。近年來FSGS發病呈上升趨勢，占我國腎活檢中原發性腎小球疾病的比例為6%～12%，是兒童及中青年ESRD的主要原因之一[2，4，5]。FSGS是以局灶節段分布的腎小球硬化為基本病理改變的一組腎小球病變[6，7]，病因包括原發性、繼發性和遺傳性。遺傳性FSGS也叫家族性FSGS。目前認為，不論是家族性FSGS，還是散發性FSGS，遺傳因素在其發病中可能都起重要作用，研究發現FSGS可以表現為明顯的家族聚集性和種族差異，例如非洲裔美國人的發病率明顯高于高加索人[8～10]。1992年Mathis等[11]首先報道FSGS可以表現為常染色體顯性遺傳模式。Brown等[12]在此基礎上克隆出第一個FSGS的致病基因ACTN4，其編碼的蛋白為α輔肌動蛋白4(α-actinin 4)。此后越來越多的FSGS 致病基因被克隆，迄今已發現數十余種基因突變參與FSGS的發病，包括TRPC6，INF2等[8，10，13～16]。這些基因突變的深入研究，對進一步闡明FSGS的發病機制具有重要作用。Winn等[17]首先從家族性FSGS患者中克隆出了一個導致家族性局灶節段性腎小球硬化(FSGS)的新基因--TRPC6，其編碼蛋白瞬時受體電位陽離子通道蛋白(transient receptor potential cation channel 6，TRPC6)是一個非選擇性陽離子通道，在足細胞表達，與裂孔隔膜分子Nephrin以及Podocin間存在相互作用，共同參與足細胞間的信號傳導、細胞極化和穩定骨架結構等生理功能[18]。因此，認識該基因、篩查可能存在的突變以及進一步研究該基因的功能將對探討FSGS的發病機制以及防治具有重要意義。本文著重介紹TRPC6致FSGS基因突變種類研究，為進一步探究其致FSGS的發病機制及防治提供理論基礎。

1 TRPC6相關基因突變研究

1.1 基本概述 瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)是一種新發現的細胞膜上的鈣通道，在各種生物細胞中有著廣泛的表達。哺乳動物TRP通道蛋白包括6個關聯的蛋白家族:TRPC、TRPV、TRPM、TRPP、TRPN以及TRPML，其中每個家族又有許多亞型。TRPC是TRP家族的主要成員之一，它的激活機制依賴于磷脂酶C(phospholipase C，PLC)信號通路，被認為是最可能的鈣庫操縱性鈣通道和受體操縱性鈣通道的分子基礎。鈣離子是細胞內的第二信使，廣泛存在于從細菌到特殊神經元等各類細胞中，在哺乳動物機體內有廣泛表達[19]。TRPC包括7個亞家族，即TRPC1～7，其中TRPC3和TRPC6在TRPC亞家族中比較有代表性[20～22]，也是目前國際研究中較受關注的2個亞型。人TRPC6 定位于染色體11q21～q22，共132365個堿基(GeneBank:NG_011476)，含13個外顯子[23]。TRPC6的編碼蛋白是一個含有931個氨基酸的通道蛋白，為6次跨膜蛋白，其N端和C端均在胞內，由第5和第6跨膜結構域共同構成非選擇性陽離子通道[24]。

1.2 突變種類 近年的研究陸續報道一些新的TRPC6突變與FSGS發病相關以來，迄今為止，已經證實15種TRPC6 基因突變參與FSGS發病(圖1)。其中，3個突變(G109S、P112Q、N125S)位于第1個錨蛋白重復區域(ankyrin repeat，ANK)區域，2個突變(M132T、N143S)位于ANK2區域，1個突變(R175Q)在ANK3區域，1個突變(H218L)位于ANK4區域，另外2個突變(S270T、L395A)位于細胞質N-末端[17，25～29]；余下6個突變(L780P、K874X、Q889K、R895C、R895L、E897K)位于細胞質C-末端[17，26，27，30]。

圖1 FSGS相關的TRPC6基因突變

2 TRPC6突變致FSGS發病的機制

2.1 TRPC6突變影響鈣離子信號通路傳導 2005年Winn等[17]首先發現P112Q突變細胞內鈣離子濃度、鈣離子峰濃度、細胞電流及TRPC6蛋白表達較突變型較野生型明顯升高。目前，通過電生理現象和/或細胞內Ca2+測量，上述15種TRPC6基因突變中的10個突變(P112Q、N143S、R895C、E897K、Q889K、M132T、N125S、H218L、R895L、R175Q突變)均可以導致鈣通道活性增加。因此，TRPC6通道是最可能的鈣庫操縱性鈣通道和受體操縱性鈣通道。TRPC6基因突變可以影響TRPC6的Ca2+通道活性，導致Ca2+內流增加，從而激活Ca2+依賴信號通路，最終導致FSGS的發生。

TRP通道與多種生物功能有關，如細胞生長、離子平衡、機械感受和依賴PLC的鈣內流等[17]；鈣作為第二信使可以影響細胞內上述的大多數功能[17，31]。血管緊張素II通過AT1受體，在包括FSGS在內的一些腎臟疾病的損傷過程中(如蛋白尿的產生及腎臟損傷的進展)起著關鍵作用[17，32]。AT1受體與異源三聚體鳥嘌呤核苷酸-G蛋白結合，激活磷脂酶C-β(PLC-β)，水解磷脂酰肌醇異構體4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，產生三磷酸肌醇(InsP3)和二酰甘油(DAG)。InsP3可迅速地從細胞膜內側向胞質溶膠中擴散，一方面打開細胞膜上的鈣通道使Ca2+進入細胞內，另一方面開啟細胞內鈣池(內質網)增加Ca2+的釋放；同時DAG也促進細胞內鈣池釋放，增加細胞內Ca2+，即InsP3和DAG兩者協同提高胞內游離鈣的濃度。胞質Ca2+含量的上升，激活一種稱為鈣調蛋白的Ca2+結合蛋白，后者可調節其他酶類的活性，并最終導致鈣調磷酸酶(CaN)的激活[17，33]。Santin等[26]在兒童和成人的非家族性FSGS中究發現的G109S、N125S、L780P突變均為錯義突變。，研究發現有此3種基因突變的患者對鈣調磷酸酶抑制劑(CNI)有較好的療效也進一步證明TRPC6突變可能使鈣信號增加，激活CaN，促進細胞凋亡，破壞了足細胞肌動蛋白細胞骨架[34]，同時阻斷CaN活性可能改善蛋白尿，這與臨床上使用環孢素、他克莫司等鈣調磷酸酶抑制劑后部分TRPC6基因突變的FSGS患者蛋白尿獲得明顯緩解的一致性進一步證實上述可能。由此可見，TRPC6突變在鈣信號通路傳導中發揮非常重要的作用。

2.2 突變影響CaN-NFAT信號通路 活化細胞核轉錄因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)是一類重要的轉錄因子，廣泛分布于機體的免疫及非免疫細胞，其活性受鈣離子依賴性的CaN的調節，主要通過受體-Ca-CaN信號途徑被激活，從而發生其基因調控功能。Koitabashi等[35]研究發現二脂酰甘油(DAG)激活TRPC6通道上的Gq蛋白偶聯受體，導致Ca2+進入鈣池，鈣離子內流可激活絲氨酸-蘇氨酸-CaN，這可以使NFAT家族的轉錄因子去磷酸化，去磷酸化NFAT入核，進一步激活某一基因程序，提供正反饋回路，進一步刺激TRPC6電流和相關的信號。另外，Schl?ndorff等[36]提出TRPC6突變相關的FSGS是由于CaN-NFAT信號途徑的激活并證實了以往報道的P112Q、R895C和E897K突變能夠顯著地刺激NFAT活化，說明FSGS TRPC6突變的確增強NFAT活化；該研究還發現環孢霉素A及FK506抑制TRPC6介導的NFAT活化，這與Gigante等[27]報道的臨床表現為SRNS的H218L突變患兒，對鈣調磷酸酶抑制劑治療敏感表現一致。以上信息說明CaN-NFAT信號通路在調節腎小球功能方面具有非常重要的作用。也為這些FSGS患者發病機理及未來的治療提供重要的線索。

2.3 突變致足細胞結構功能改變 已經報道TRPC6 mRNA在多種組織中表達，包括腎臟、腦、肺、卵巢等[17，37～39]。Winn等用針對人TRPC6的抗體證實TRPC6在腎小球和腎小管均有表達，進一步的熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)實驗表明TRPC6 mRNA在腎小球和腎小管彌漫性表達，與免疫熒光染色幾乎相同。Reiser等[25]應用免疫熒光雙標記顯示在足細胞TRPC6與Nephrin、Podocin和CD2AP存在共定位分布，免疫沉淀結果還提示TRPC6與Nephrin、Podocin有相互作用，而與CD2AP間無相互作用。此外，他們還發現Nephrin敲除小鼠足細胞內TRPC6表達增加而且分布也發生了改變，呈顆粒聚集樣表現，這提示Nephrin缺失誘發了TRPC6表達的增加和分布的改變。另有研究[27]發現H218L、R895L突變型患者腎小球的TRPC6表達明顯上調，nephrin表達卻明顯下調，同時觀察到nephrin的蛋白質沿毛細血管袢不規則分布；其中表現為R895L突變的塌陷型患兒的TRPC6在新月形上皮細胞明顯上調。以上事實表明TRPC6屬于裂孔隔膜蛋白，它與Nephrin、Podocin等重要的裂孔隔膜分子共同組成一個信號傳導復合物以維持足突和裂孔隔膜結構和功能的完整性。TRPC6突變導致足細胞鈣內流而引起細胞骨架過度收縮，使得細胞骨架對腎小球濾過靜水壓作出失適應性反應，最終引起足細胞結構和功能受損；TRPC6突變蛋白與Nephrin、Podocin等裂孔隔膜分子相互作用發生紊亂，從而干擾了由它們所組成的裂孔隔膜信號復合體的功能，最終導致足細胞不能維持正常的生物學功能。

3 TRPC6突變所致FSGS臨床特征分析

TRPC6基因突變在FSGS患者中的發生情況還不太清楚，不同研究報道的差異較明顯。我們總結了目前所報道的家族性FSGS和散發性FSGS患者中TRPC6突變的情況，見表1。根據家族史分析，所有家系的遺傳方式均為常染色體顯性遺傳，每個氨基酸的取代均為進化上的高度保守的殘基。存在攜帶有TRPC6突變但無臨床表現的個體。中國TRPC6突變占家族性FSGS的比例約3.2%，其他種族約為7%。這些家族患病個體在30～40歲開始出現大量蛋白尿，其中大約60%進展為ESRD，從開始出現臨床表現至進展為ESRD時間約為10年。患者腎臟病理表現多為FSGS。散發性FSGS患者無特異性表現。M132T突變是首次報道的可以導致早發型的FSGS，早發型FSGS多表現為早發(最小發病年齡為1歲)和SRNS，但對鈣調磷酸酶抑制劑(如環孢素A、FK506)治療敏感；其中早發型FSGS腎臟活檢為塌陷型的腎小球硬化患者可迅速進展為ESRD。

表1 TRPC6基因突變致FSGS臨床總結

注:家系研究的例數是指研究所納入的家系數；家系中的突變陽性率指所有家系中發生突變的家系數。

目前有關TRPC6基因突變的研究取得較大進展，但是TRPC6基因突變與FSGS的確切發生機制仍不十分清楚，需要更多的體外功能試驗甚至建立動物模型試驗來明確，同時FSGS的進一步防治也需要進一步探索。

[1] Hofstra JM.New TRPC6 gain-of-function mutation in a non-consanguineous Dutch family with late-onset focal segmental glomerulosclerosis[J].Nephrol Dial Transplant，2013，28(7)：1830-1838.

[2] D′Agati VD，Kaskel FJ，Falk RJ.Focal segmental glomerulosclerosis[J].N Engl J Med，2011，365(25)：2398-2411.

[3] Haas M.Changing etiologies of unexplained adult nephrotic syndrome：a comparison of renal biopsy findings from 1976-1979 and 1995-1997[J].Am J Kidney Dis，1997，30(5)：621-631.

[4] Zhou FD.The changing spectrum of primary glomerular diseases within 15 years：a survey of 3331 patients in a single Chinese centre[J].Nephrol Dial Transplant，2009，24(3)：870-876.

[5] 陳惠萍.10594例腎活檢病理資料分析[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2000，9(6):501-509.

[6] D′Agati VD.Pathologic classification of focal segmental glomerulosclerosis：a working proposal[J].Am J Kidney Dis，2004，43(2)：368-382.

[7] Deegens JK.Pathological variants of focal segmental glomerulosclerosis in an adult Dutch population-epidemiology and outcome[J].Nephrol Dial Transplant，2008，23(1)：186-192.

[8] Pollak MR.Focal segmental glomerulosclerosis：recent advances[J].Curr Opin Nephrol Hypertens，2008，17(2)：138-142.

[9] Haas M.Changing etiologies of unexplained adult nephrotic syndrome：a comparison of renal biopsy findings from 1976-1979 and 1995-1997[J].Am J Kidney Dis，1997，30(5)：621-631.

[10]李貴森，王慶文.局灶節段性腎小球硬化的遺傳背景[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2010，19(4)：373-377.

[11]Mathis BJ，Calabrese KE，Slick GL.Familial glomerular disease with asymptomatic proteinuria and nephrotic syndrome：a new clinical entity[J].J Am Osteopath Assoc，1992，92(7)：875-884.

[12]Kaplan JM.Mutations in ACTN4，encoding alpha-actinin-4，cause familial focal segmental glomerulosclerosis[J].Nat Genet，2000，24(3)：251-256.

[13]Brown EJ.Mutations in the formin gene INF2 cause focal segmental glomerulosclerosis[J].Nat Genet，2010，42(1)：72-76.

[14]Lowik MM.Molecular genetic analysis of podocyte genes in focal segmental glomerulosclerosis-a review[J].Eur J Pediatr，2009，168(11)：1291-1304.

[15]Kopp JB.MYH9 is a major-effect risk gene for focal segmental glomerulosclerosis[J].Nat Genet，2008，40(10)：1175-1184.

[16]Woroniecki RP，Kopp JB.Genetics of focal segmental glomerulosclerosis[J].Pediatr Nephrol，2007，22(5)：638-644.

[17]Winn MP.A mutation in the TRPC6 cation channel causes familial focal segmental glomerulosclerosis[J].Science，2005，308(5729)：1801-1804.

[18]Huber TB，Schermer B，Benzing T.Podocin organizes ion channel-lipid supercomplexes：implications for mechanosensation at the slit diaphragm[J].Nephron Exp Nephrol，2007，106(2)：e27-31.

[19]張瑤，于力.瞬時受體電位陽離子通道蛋白6與腎臟疾病[J].臨床兒科雜志，2010，28(6)：594-597.

[20]Moller CC.Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease[J].J Am Soc Nephrol，2007，18(1)：29-36.

[21]Kim YH.Podocyte depletion and glomerulosclerosis have a direct relationship in the PAN-treated rat[J].Kidney Int，2001，60(3)：957-968.

[22]Pagtalunan ME.Podocyte loss and progressive glomerular injury in type II diabetes[J].J Clin Invest，1997，99(2)：342-348.

[23]Beech DJ.Emerging functions of 10 types of TRP cationic channel in vascular smooth muscle[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2005，32(8)：597-603.

[24]Estacion M.Activation of human TRPC6 channels by receptor stimulation[J].J Biol Chem，2004，279(21)：22047-22056.

[25]Reiser J.TRPC6 is a glomerular slit diaphragm-associated channel required for normal renal function[J].Nat Genet，2005，37(7)：739-744.

[26]Santin S.TRPC6 mutational analysis in a large cohort of patients with focal segmental glomerulosclerosis[J].Nephrol Dial Transplant，2009，24(10)：3089-3096.

[27]Gigante M.TRPC6 mutations in children with steroid-resistant nephrotic syndrome and atypical phenotype[J].Clin J Am Soc Nephrol，2011，6(7)：1626-1634.

[28]Heeringa SF.A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS[J].PLoS One，2009，4(11)：e7771.

[29]Mir S.TRPC6 gene variants in Turkish children with steroid-resistant nephrotic syndrome[J].Nephrol Dial Transplant，2012，27(1)：205-209.

[30]Zhu B.Identification and functional analysis of a novel TRPC6 mutation associated with late onset familial focal segmental glomerulosclerosis in Chinese patients[J].Mutat Res，2009，664(1-2)：84-90.

[31]Yamamoto M，Hara H，Adachi T.The expression of extracellular-superoxide dismutase is increased by lysophosphatidylcholine in human monocytic U937 cells[J].Atherosclerosis，2002，163(2)：223-228.

[32]Taal MW，Brenner BM.Renoprotective benefits of RAS inhibition：from ACEI to angiotensin II antagonists[J].Kidney Int，2000，57(5)：1803-1817.

[33]Balla T.Signaling events activated by angiotensin II receptors：what goes before and after the calcium signals[J].Endocr Res，1998，24(3-4)：335-344.

[34]Faul C.The actin cytoskeleton of kidney podocytes is a direct target of the antiproteinuric effect of cyclosporine A[J].Nat Med，2008，14(9)：931-938.

[35]Koitabashi N.Cyclic GMP/PKG-dependent inhibition of TRPC6 channel activity and expression negatively regulates cardiomyocyte NFAT activation Novel mechanism of cardiac stress modulation by PDE5 inhibition[J].J Mol Cell Cardiol，2010，48(4):713-724.

[36]Schlondorff J.TRPC6 mutations associated with focal segmental glomerulosclerosis cause constitutive activation of NFAT-dependent transcription[J].Am J Physiol Cell Physiol，2009，296(3)：C558-569.

[37]Conlon PJ.Spectrum of disease in familial focal and segmental glomerulosclerosis[J].Kidney Int，1999，56(5)：1863-1871.

[38]Riccio A.mRNA distribution analysis of human TRPC family in CNS and peripheral tissues[J].Brain Res Mol Brain Res，2002，109(1-2)：95-104.

[39]Garcia RL，Schilling WP.Differential expression of mammalian TRP homologues across tissues and cell lines[J].Biochem Biophys Res Commun，1997，239(1)：279-283.

Mutations of TRPC6 and pathogenesis of focal segmental glomerulosclerosis

PENG Mei1，2，LI Gui-sen2

四川省青年科技創新研究團隊基金資助項目(編號:2015TD0013)

R692.6

B

1672-6170(2016)03-0170-04

2015-09-28；

2015-11-30)

△通訊作者