結(jié)核分枝桿菌mpt64基因突變研究

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(1、南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東廣州510515；2、深圳市蛇口人民醫(yī)院，廣東深圳518067；3、南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，廣東廣州510900)

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結(jié)核分枝桿菌mpt64基因突變研究

毛欣茹1，張?jiān)娒?，尹小毛3

(1、南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東廣州510515；2、深圳市蛇口人民醫(yī)院，廣東深圳518067；3、南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，廣東廣州510900)

摘要:目的分析結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）mpt64基因突變情況。方法提取MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv 和45株MTB臨床株的DNA，擴(kuò)增mpt64基因并進(jìn)行序列分析。結(jié)果MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和44株MTB臨床株的mpt64基因無(wú)突變，1株MTB臨床分離株的mpt64基因存在63個(gè)堿基的缺失突變。結(jié)論結(jié)核分枝桿菌mpt64基因突變頻率低。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；mpt64基因；突變分析；非結(jié)核分枝桿菌

結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）在生長(zhǎng)早期會(huì)分泌一些特異蛋白，其中包括分泌量較大的MPT64蛋白[1，2]。近年來(lái)，該蛋白作為MTB的生長(zhǎng)指示蛋白在分枝桿菌的鑒別中發(fā)揮了重要作用，目前臨床實(shí)驗(yàn)室通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基中是否存在該靶蛋白就能輕松實(shí)現(xiàn)MTB的快速鑒定[3，4]。此外，MTB分泌的MPT64蛋白可刺激被感染者產(chǎn)生針對(duì)該蛋白的特異性抗體，實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)檢測(cè)患者血清中的抗MPT64抗體即可為臨床結(jié)核病的診斷提供參考依據(jù)[5]。mpt64基因?yàn)镸PT64蛋白的編碼基因，該基因突變后表達(dá)的突變型蛋白與野生型蛋白在抗原特性上存在較大差異，從而可導(dǎo)致MTB的鑒定和抗MPT64抗體的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。基于上述背景，本研究對(duì)MTB臨床菌株的mpt64基因突變情況進(jìn)行了初步分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1菌株MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由深圳市慢性病防治中心惠贈(zèng)，45株MTB臨床株分離自結(jié)核病患者的痰液或支氣管肺泡灌洗液，均通過(guò)生化反應(yīng)和分子鑒定相結(jié)合的方法鑒定為MTB。

1.2試劑DNA提取液購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，Capilia TB assay MPT64檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司，Takara TaqTM普通PCR試劑購(gòu)自大連寶生生物公司。

1.3 DNA的提取刮取少許菌落于滅菌水中并配制成1個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海又?ml菌懸液至1.5ml微量離心管中，然后10000g離心5min。離心后棄掉上清液并加入40μl DNA提取液，振蕩混勻后置100℃裂解15min，取出冷卻后于13000g離心10min。離心結(jié)束后吸取上清液至另一去核酸的1.5ml微量離心管中，放置于-20℃處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 mpt64基因序列分析參照文獻(xiàn)[6]合成PCR上下游擴(kuò)增引物，上游引物為5'-CAGGCATCGTCGT CAGCAGC-3'，下游引物為5'-GTCCTCGCGAGTC TAGG CCA-3'。PCR反應(yīng)總體積為50μl，包括5μl10×PCR Taq Buffer、4μl 2.5mM dNTP溶液、50μM引物各0.5μl、1.25U Taq DNA聚合酶和2μl模板溶液。PCR反應(yīng)管置于Mastercycler ep gradient thermocycler中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min，94℃變性15s、60℃退火15s、72℃延伸30s共30個(gè)循環(huán)，72℃補(bǔ)齊1min。擴(kuò)增結(jié)束后采用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，然后將片段大小符合且亮度高的PCR產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用Chromas 2軟件進(jìn)行觀察，DNA序列采用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 MPT64蛋白檢測(cè)于無(wú)菌試管中加入0.2ml滅菌生理鹽水，用一次性接種環(huán)在轉(zhuǎn)種培養(yǎng)基上刮取少許菌落并轉(zhuǎn)移至生理鹽水中。將菌落研磨均勻后配制成1個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海o置3～5min備用。拆開(kāi)已恢復(fù)至常溫的Capilia TB assay MPT64檢測(cè)試劑盒，取出檢測(cè)板并進(jìn)行編號(hào)。吸取100μl菌懸液加入到檢測(cè)板的圓形加樣孔中，靜置15min后觀察結(jié)果。觀察孔的控制線處出現(xiàn)紫紅色條帶后判讀結(jié)果，否則需更換檢測(cè)板后重新進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)線處出現(xiàn)紅色或紫紅色條帶表明MPT64蛋白檢測(cè)陽(yáng)性，檢測(cè)線處無(wú)紫紅色條帶出現(xiàn)表明菌懸液中不含MPT64蛋白。

2　結(jié)果

MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和44株MTB臨床株的mpt64基因無(wú)突變，其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為817bp。1株MTB臨床分離株的mpt64基因存在63個(gè)堿基的缺失突變（66位到86位氨基酸），故其擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度只有731bp；當(dāng)用MPT64蛋白檢測(cè)試劑對(duì)該株MTB的生長(zhǎng)濾液進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其測(cè)定結(jié)果為陰性。

3　討論

MPT64蛋白是MTB特異性分泌蛋白，在非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）的培養(yǎng)濾液中沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)或含量很低，故該蛋白被視為一種理想的可用于MTC和NTM鑒別的蛋白標(biāo)志物。上世紀(jì)末研究人員應(yīng)用膠體金標(biāo)記的抗MPT64單克隆抗體開(kāi)發(fā)了一種用于MPT64蛋白檢測(cè)的膠體金免疫層析試劑盒，并將其用于分枝桿菌培養(yǎng)物的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了MTC與NTM的快速鑒別[1]。此后十多年間大量的研究證實(shí)，這種檢測(cè)試劑盒在鑒別MTC與NTM方面都具有很好的靈敏度和特異度，可替代傳統(tǒng)方法用于臨床實(shí)驗(yàn)室中分枝桿菌的快速鑒別[7－11]。

另一方面，膠體金免疫層析法鑒別MTC和 NTM時(shí)產(chǎn)生的假陰性結(jié)果也逐漸引起研究人員和臨床實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)家的注意[12]。其主要原因是對(duì)mpt64基因存在突變的MTC菌株缺乏準(zhǔn)確鑒別的能力，因基因突變導(dǎo)致表達(dá)的MPT64蛋白發(fā)生序列和結(jié)構(gòu)改變，從而不能被特異結(jié)合野生型MPT64蛋白的單克隆抗體所識(shí)別，最終導(dǎo)致MPT64檢測(cè)產(chǎn)生假陰性結(jié)果。因而在鑒別MTC和NTM時(shí)，一些分泌突變型MPT64蛋白的MTC菌株就會(huì)因假陰性結(jié)果而被錯(cuò)誤鑒別為NTM[13]。

本研究采用測(cè)序方法對(duì)45株MTB臨床株的mpt64基因進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該基因在絕大多數(shù)MTB臨床菌株中均未發(fā)生突變，這說(shuō)明mpt64基因的突變頻率很低，該基因突變不會(huì)對(duì)臨床應(yīng)用MPT64蛋白檢測(cè)來(lái)鑒別分枝桿菌產(chǎn)生影響。另一方面，1株MTB的mpt64基因存在43位到63位氨基酸共63個(gè)堿基的缺失，這種缺失突變?cè)谥暗奈墨I(xiàn)中已有報(bào)道[13]。已有研究對(duì)MPT64檢測(cè)陰性的MTB菌株進(jìn)行mpt64基因突變分析，除發(fā)現(xiàn)上述的缺失突變外，還發(fā)現(xiàn)了一些其它突變類(lèi)型，包括堿基插入、堿基替換和其它位點(diǎn)的堿基缺失等[14，15]。這些突變均可導(dǎo)致表達(dá)的MPT64分泌蛋白與野生型MPT64蛋白在結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)差異，從而使突變型MPT64蛋白不能被膠體金免疫層析試劑中的抗MPT64單克隆抗體識(shí)別，最終導(dǎo)致MPT64檢測(cè)假陰性結(jié)果的出現(xiàn)[16]。

綜上所述，現(xiàn)有研究表明mpt64基因突變的MTB菌株比例較低，因此不會(huì)影響到膠體金免疫層析法鑒別MTC和NTM的性能和其在臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用價(jià)值。但是，臨床實(shí)驗(yàn)室在應(yīng)用該方法的同時(shí)，需嚴(yán)密監(jiān)測(cè)mpt64基因突變MTB菌株比例的上升幅度，如果該類(lèi)菌株的比例升高到一定程度并對(duì)膠體金免疫層析法的鑒別性能產(chǎn)生明顯影響時(shí)，臨床實(shí)驗(yàn)室必須對(duì)該方法重新進(jìn)行性能評(píng)價(jià)并決定是否繼續(xù)使用。

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Study on mpt64 gene mutation of Mycobacterium tuberculosis

MAO Xinru1，ZHANG Shimeng2，YIN Xiaomao3. 1.Nanfang Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2.Shenzhen Shekou People’s Hospital，Shenzhen Guangdong 518067，China；3.The Fifth Affiliated Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510900，China.

Abstract：Objective To investigate the mpt64 gene mutation situation of Mycobacterium tuberculosis (MTB). Methods DNA extraction was performed from reference strain H37Rv and 45 clinical MTB isolation strains. Then the amplification and sequencing of mpt64 gene were accomplished. Results No mution of mpt64 gene was found in H37Rv and clinical isolation strains except for one clinical MTB strain had a deletion of 63 nucleotides. Conclusion The mutation prevalence of mpt64 gene of MTB is low.

Key words:Mycobacterium tuberculosis；mpt64 gene；Mutation analysis；Nontuberculous mycobacteria

(收稿日期2016-01-07；修回日期2016-03-22)

通信作者：尹小毛，男，1981年10月出生，主管技師，博士研究生，主要研究方向?yàn)楦腥拘约膊〉目焖僭\斷。

作者簡(jiǎn)介：毛欣茹，女，1989年2月出生，技師，碩士研究生，主要研究方向?yàn)楦腥拘约膊〉目焖僭\斷。

基金項(xiàng)目：廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A020212173），南方醫(yī)科大學(xué)科研啟動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（C1031780）

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.02.003

中圖分類(lèi)號(hào)：R378.91，Q523

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-1129(2016)02-0137-03