結核分枝桿菌實驗室診斷方法及評價

胡彥綜述，陳娟娟，王小中審校(、南昌大學0級卓越醫師班，江西南昌330006；、南昌大學第二附屬醫院檢驗科，江西南昌330006)

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結核分枝桿菌實驗室診斷方法及評價

胡彥1綜述，陳娟娟2，王小中2審校
(1、南昌大學2012級卓越醫師班，江西南昌330006；2、南昌大學第二附屬醫院檢驗科，江西南昌330006)

摘要：目前，我國的結核病(tuberculosis，TB)疫情已相當嚴重，結核病的防治形勢亦十分嚴峻。因而，如何快速診斷、盡早治療結核病，在控制疫情方面顯得尤為重要。近20年，結核病的實驗室診斷技術得到了較大的發展，主要有以下三個方面：細菌學檢查方法、免疫學診斷技術和分子生物學診斷技術。

關鍵詞：結核病；分枝桿菌；實驗室診斷

結核病是一種由結核分枝桿菌（Mycobacterium Tuberculosis，MTB）感染，嚴重危害人類健康的慢性傳染病。依據世界衛生組織(WHO)2013年全球結核報告[1]，2012年新發結核病患者約860萬例，其中約130萬例患者死亡。近年來，我國結核病發病率逐年上升，大約30%的人口感染MTB，其中約10%發展為活動性結核病[2]。目前臨床上檢測MTB的方法眾多，不同方法的臨床性能不一[3－5]。由于診斷方法的落后和遲緩使結核病的控制變得復雜而困難。在結核病防治的嚴峻形勢下，早期診斷便成為控制結核病傳染的關鍵因素。

1　細菌學檢查

1.1痰涂片染色鏡檢法

1.1.1萋－尼氏（Z－N）抗酸染色法用萋－尼氏抗酸染液對痰涂片進行染色后，用普通光學顯微鏡鏡檢。在100倍油鏡下進行觀察，發現抗酸桿菌1～8 條/300視野者報告為陽性，全片300個視野未發現抗酸桿菌者報告為陰性。平均每張Z－N染色痰涂片閱片時間為4.4min。袁薇等[6]對658份門診病人痰標本進行檢測，Z－N染色陽性319份，涂片陽性率為48%。國外有文獻報道[7]抗酸染色陽性率僅占0%～44%。因該法具有操作簡單、檢測迅速、價格低廉、特異度高等優點，故成為結核病實驗室、特別是低收入且結核病高負擔國家的實驗室最廣泛使用的主要診斷技術之一。

1.1.2熒光染色鏡檢法其原理為：使用熒光染料對抗酸桿菌進行染色，染色后使用特定波段的光束進行照射，與菌體結合的染料可被激發后產生熒光亮點。常先用20倍物鏡對痰涂片進行鏡檢，發現可疑的熒光桿狀物質后，再使用40倍物鏡確認，只要求觀察50個視野即可。讀片時間為1～3min，在陰性結果的玻片上具有明顯優勢。國外有文獻報道[8]，熒光染色法檢出抗酸桿菌的敏感度約提高10%，且保持了相似的特異度。

1.2結核菌培養法

1.2.1改良羅氏培養法（L－J法）在接種處理后的痰標本3d、7d分別觀察菌落生長情況，然后每周觀察結果一次。觀察發現菌落生長，經抗酸染色證實為抗酸桿菌后，可報告結核分支桿菌培養陽性，若8周仍無菌落生長，則報告培養陰性。李寧等[9]對1030例疑似結核病患者的3090份痰標本進行培養，陽性率為7.1%，污染率2.1%。該方法具有能保持細菌形態、觀察并記錄菌落形成過程、對菌落進行定量、進行耐藥性試驗和菌型鑒定、實驗費用低等優點。但同時因耗時長，敏感性不高而限制其實際應用。

1.2.2 Bactec－460TB檢測系統其原理為：將痰標本接種于含有14C棕櫚酸的7H12B培養基中，用Bactec－460TB儀自動檢測分支桿菌的代謝產物14C的放射活性，并換算成生長指數(GI)值，然后對GI值進行分析報告。如果GI升高達某一程度，則報告有分支桿菌生長，即為陽性。國外有文獻[10]報道，該方法陽性率約為80%，比傳統的改良羅氏培養法明顯提高；檢測時間約9～14d，明顯比改良羅氏培養法縮短。但本方法因底物具有放射性、試劑和儀器設備昂貴而使其推廣受限。同時，在藥敏試驗中，因菌量難定，也在使其標準化困難。

1.2.3 Bactec MGIT960TB檢測系統是一種集分枝桿菌快速生長培養、檢測及藥敏技術為一體的全自動分枝桿菌培養儀。其原理為：將對氧濃度變化高度敏感的熒光顯示劑包埋于含有Middebrook7H9液體培養管中，通過測定O2濃度的變化來監測分支桿菌的生長狀態。當氧分子被消耗時，培養基的氧化還原電勢降低，指示劑則發熒光。在365mm波長的紫外光照射下觀察，有熒光出現者則為陽性結果。Katila等[11]報道，MGIT960TB系統對MTB培養陽性率為82.5%～94%，所需的時間為12d左右。該檢測方法具有檢出率高、特異性強、時間較傳統培養法明顯縮短等優點。與Bactec－460法相比，無放射性污染，但儀器、試劑更貴，不易在基礎診治單位推廣。

1.3噬菌體擴增法其原理為：D29噬菌體侵入標本中活的MTB體內，在菌體內增殖。用噬菌體殺滅劑將游離噬菌體殺死后，加入指示細胞。MTB內的D29噬菌體大量增殖后釋放，感染指示細胞，導致指示細胞破裂并在瓊脂板上出現噬菌斑。根據噬菌斑的有無，即可確定標本中有無活的MTB。趙慶華等[12]采用噬菌體法和痰涂片法對269例結核住院患者的痰標本進行檢測，噬菌體法檢測MTB陽性57例，陰性212例；涂片法陽性60例，陰性209例。采用噬菌體生物擴增法檢測臨床痰標本中的MTB，只要痰標本中有少量的MTB(200～500條/ml)即可被檢出[13]。噬菌體法可檢測活的MTB，可評價臨床治療療效，能彌補涂片法不能區分死菌活菌的不足，具有很好的臨床應用價值。

2　免疫學診斷技術

2.1 T細胞斑點試驗（T－SPOT.TB）是一種簡便的酶聯免疫斑點（ELISPOT）檢測方法。其原理為：MTB感染后機體內存在具有抗原特異性的記憶T細胞。用早期分泌靶向抗原（ESAT－6）和培養濾過蛋白（CFP－10）刺激后[14]，記憶T細胞迅速活化增殖，并分泌干擾素。在γ－干擾素擴散稀釋前，立即捕獲細胞周圍所分泌的γ－干擾素，以此來計數活化的結核特異效應T細胞。據Diel等[15]的Meta數據分析報道，T－SPOT.TB診斷肺結核的敏感性為85%～90%。Zhang等[16]報道在抗結核治療1、3、6個月后，T－SPOT.TB陽性率逐月降低，分別為94.4%、86.4%及61.5%，監測效果明顯。同時T－SPOT.TB有助于預防性抗結核病的治療，斑點越多則發生活動性結核的可能性越大，短期內斑點明顯增多則提示體內有結核活動[17]。因其目前操作復雜、成本昂貴，使得該方法在臨床的推廣與應用受限。

2.2酶聯免疫吸附法（ELISA）ELISA法檢測是應用血清免疫學檢測患者患肺外結核的重要方法之一，在結核病血清學診斷方面研究最多、應用最廣[18，19]。其原理為：將抗原或抗體吸附于固體載體模板上，并使標本和酶結合物在其上發生酶催化反應，利用呈色的底物檢測抗原抗體。該方法目前還不成熟，其檢測所用的抗原因菌種、純化程度、抗原成分等方面的不同，導致其檢測結果的差異性較大，敏感性和特異性也不穩定[20]。Kashyap等[21]采用間接ELISA方法，應用Ag85復合物的單克隆抗體檢測血清標本中該抗原。目前國內資料[22]報告其敏感性為88.5%，特異性為97.3%。結核病的血清抗體滴度與臨床經過呈正相關。

2.3結明(Myco DotTM)實驗結明試劑是美國Dyna-Gen公司的專利產品，結明實驗的原理為：脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)是一類存在于分枝桿菌表面的糖脂，作為構成分枝桿菌細胞壁的主要成分，是結核病感染過程中重要的免疫反應調節因子，同時也是目前應用最廣泛的結核特異性抗原之一[23]。LAM作為抗原固定在電泳梳上，把該電泳梳至于被測血清或全血中，當標本中存在LAM抗體時，則發生抗原抗體結合反應。將已結合抗原抗體的電泳梳至于顯色液中，梳上附有抗原處會形成紅色圓形斑點，即為陽性。當有結核病活動時，呈陽性紅斑，若為有卡介苗接種史、既往結核病史、健康人則無紅斑。結明實驗操作簡單、診斷迅速、無需特殊儀器設備，但因依賴國外進口，導致基層推廣受限。

2.4斑點金標免疫滲濾法(DIGFA)其原理為：以硝酸纖維素膜為載體，將分離純化的MTB特異性外膜蛋白或LAM點樣并固化在其上，用于捕獲人血清中MTB IgG抗體，采用葡萄球菌A蛋白(SPA)膠體金綴合物標記呈色，在膜上顯紅色斑者為陽性，白色背景者為陰性。李玉明等[24]利用純化MTB細胞壁38KDa蛋白抗原來檢測胸腔積液中相應的IgG抗體，陽性率為58.9%，顯著高于非結核性胸膜炎組(6.6%)。閏國蕊等[25]報道該法特異度為93.0%，靈敏度為71.4%。從以上報道可以看出，DIGFA法具有簡便、快速、敏感性高、特異性好等優點。可測定單個標本，且結果穩定，重復性好，適合于醫院診斷結核病感染和流行病學的調查。

3　分子生物技術

3.1聚合酶鏈反應（PCR）其原理為：以待擴增的DNA分子為模板，以一對人工合成的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下使目的片段延伸直至完成新DNA的合成。Elbir等[26]開發出了一種新的方法，在PCR檢測前進行DNA的純化，直接把PCR反應的混合物加入乙醇中，應用IS6110插入序列，檢測了44種標本，檢測結果全部陽性，簡化了試驗步驟，降低了操作難度。Sharma等[27]研究發現，在確診結核組中以IS6110和devR作為引物進行多重PCR檢測的陽性率為97.5%。本法的優點：敏感度比培養法高，并已有商品試劑及循環儀供應。缺點：易受外界同源DNA污染，標本中存在抑制物，有較高的假陽性率和假陰性率。

3.2蛋白芯片檢測將MTB的特異性細胞壁脂多糖抗原LAM和經基因工程重組DNA技術生產純化的結核菌的16000和38000特異性抗原固定在微孔濾膜這一固定的載體上，利用其滲濾、濃縮、凝集作用制作成芯片檢測樣本血清中相應的MTB IgG抗體。當這三種抗原任一對應的抗體陽性時，即可診斷為MTB感染。米琳[28]報道，確診為結核病患者中，蛋白芯片檢測法陽性率為56.8%。該法具有操作簡單、檢測迅速、成本較低的優點。但由于其檢測的是相應的特異性抗原，故當機體免疫力低下時，其陽性率會受到影響。

3.3 DNA芯片技術該技術是將MTB DNA的保守片段（插入序列IS6110）分數段固定在芯片上，與MTB雜交，以檢測MTB。梁桂亮等[29]對109例結核患者標本進行檢測，檢測出MTB 105例，陽性率為96.33%。Pang等[30]從多方面評價DNA芯片技術在耐多藥結核診斷中的價值，結果顯示DNA芯片檢測利福平耐藥的敏感度及特異度分別為87.56% 及97.95%，檢測異煙肼耐藥的敏感度及特異度分別為80.34%和95.83%，其檢測效果優于傳統藥敏試驗，并且高效、快速及安全。該方法具有操作簡單、檢測迅速、通用量大、可鑒別臨床常見的17種分支桿菌。但因其敏感性與芯片的菌種譜、痰標本的菌量有關，故該法受其檢測靈敏度的限制。

綜上所述，科學技術的飛速發展使得結核病的實驗室診斷在多方面取得了很大的進展，發展出了許多新方法和新技術，為結核病的診斷提供了許多用價值的新指標。但部分新技術因其檢測成本、操作技術等方面的限制，尚無法在基層推廣。希望在廣大醫務工作者的不懈努力下，結核病的診斷技術能不斷完善和發展，提高結核病的早期診斷率，有效控制結核病的傳染和改善預后。

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·質量控制·

·質量控制·

(收稿日期2016-02-23；修回日期2016-03-28)

通信作者：陳娟娟，女，1983年4月生，博士，主治醫師，E- mail：moo nlikecj@163.com；王小中，男，1973年12月生，教授，博士生導師。

作者簡介：胡彥，女，1995年1月出生，南昌大學2012級卓越醫師班，本科在讀。

基金項目：國家自然科學基金青年基金（81401964）；江西省青年科學基金（20142BAB215058）；南昌大學創新學分項目（14001849）；江西省教育廳青年基金（GJJ14185）

DOI：10.3969/j.issn.1674－1129.2016.02.016

中圖分類號：R378.91+1

文獻標識碼：A

文章編號：1674－1129(2016)02－0177－03