隨機轉座子插入構建甲型副傷寒桿菌啟動子文庫

許澤仰，洪愉，馮夢蝶，毛普加，趙繼華，楊洪文，宋武戰，王紀愛，黃芬，井申榮，曾韋錕

（1.昆明理工大學醫學院，昆明650500；2.昆明學院醫學院臨床檢驗教研室，昆明650214；3.成都軍區昆明總醫院核醫學科，昆明650032）

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隨機轉座子插入構建甲型副傷寒桿菌啟動子文庫

許澤仰1，2，洪愉3，馮夢蝶1，毛普加1，趙繼華3，楊洪文3，宋武戰3，王紀愛2，黃芬1，井申榮1，曾韋錕1，2

（1.昆明理工大學醫學院，昆明650500；2.昆明學院醫學院臨床檢驗教研室，昆明650214；3.成都軍區昆明總醫院核醫學科，昆明650032）

摘要目的構建攜帶氯霉素乙酰轉移酶（CAT）的轉座子自殺性質粒，通過接合轉座獲得甲型副傷寒沙門氏菌（副甲）啟動子文庫。方法PCR擴增CAT的基因亞克隆至pMD?18T載體，鑒定正確后酶切插入轉座子自殺性質粒pSC189，獲得新的轉座子載體pSC?CAT，將攜帶pSC?CAT的供體菌與副甲受體菌進行接合轉座，涂布氯霉素平板篩選轉座的細菌，以隨機篩選出來的細菌基因組為模板，熱不對稱PCR擴增插入位點側翼序列，并進行測序、比對分析。結果篩選獲得約1 000個突變菌，隨機挑取6個菌，轉座子插入位點的上游分別對應6個可疑啟動子區域。結論通過自殺性轉座子載體pSC?CAT可高效獲得副甲菌啟動子文庫，為進一步研究副甲菌基因表達與調控奠定了基礎。

關鍵詞甲型副傷寒沙門氏菌；氯霉素乙酰轉移酶；pSC189；接合轉移轉座

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Constructionofa Promoter Libraryof SalmonellaparatyphiAby Inserting Transposon

XU Ze?yang1，2，HONG Yu3，FENG Meng?die1，MAO Pu?jia1，ZHAO Ji?hua3，YANG Hong?wen3，SONG Wu?zhan3，WANG Ji?ai2，HUANGFen1，JINGShen?rong1，ZENGWei?kun1，2
（1.Medical Faculty，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China；2.Department of Clinical Laboratory，Medical Faculty，Kunming Uni?versity，Kunming650214，China；3.Departmentof Nuclear Medicine，Kunming General Hospitalof Chengdu Military Command，Kunming650032，China）

Abstract Objective To establish a promoter library of SalmonellaparatyphiA by transposition with new suicide plasmid with transposon，which containingchloramphenicolacetyltransferase（CAT）asthereportgene.Methods The CATgeneofwasamplifedby PCRandclonedintopMD18?T vector.The above fragment was then inserted to suicide plasmid pSC189，and the new plasmid was named pSC?CAT.After conjugation between S17?1λpir/pSC?CAT and SalmonellaparatyphiA，the mixer was put on the plate containing chloramphenicol to screen the transductants.The ge?nome of random picked bacteria was extracted as template of the thermal asymmetric interlaced PCR（Tail?PCR）to amplify flanking sequence near insertion site.The PCR products were sequenced and analysed with blast.Results About 1000mutant strains were got.Six suspicious promoter re?gions were found in the front of inserted site from six random selected bacteria.Conclusion A promoter library of Salmonella paratyphi A could be effectively established through suicide vector pSC?CAT，which laid a foundation for further study of gene expression and regulation of Salmonella paratyphiA.

Keywords Salmonella paratyphi A；chloramphenicol acetyltransferase；pSC189；conjugate transpose

甲型副傷寒沙門氏菌引起的腸熱病，在發達和發展中國家都并不罕見，是一個重要的公共衛生問題［1］。副傷寒可引起高燒、腹痛等癥狀，嚴重者可導致死亡［2，3］。在全球范圍內每年大約有2 100萬人患病，其中約70萬人死亡，主要發生在東南亞、非洲和拉丁美洲等地［4］。目前對于甲型副傷寒沙門氏菌研究相對較少，深入研究該菌的生物學特性和致病機制具有重要的現實意義。

啟動子是細胞內基因表達的必要調控原件，決定了基因表達的強度和時機，通過影響啟動子可以改變細胞基因的表達［5］，研究致病菌的各種生命活動及代謝調控，能夠控制致病菌的感染及傳播。

篩選啟動子的方法通常是用啟動子陷阱載體，比如作者前期構建的甲型副傷寒沙門氏菌啟動子文庫［6］。該方法需要提取基因組，酶切后插入啟動子陷阱載體，實驗過程復雜，如報告子選用非抗性基因，背景較雜，篩選工作量大。為了獲得方便、簡單的啟動子文庫菌，本研究以氯霉素乙酰轉移酶（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）為報告基因插入轉座子自殺性載體pSC189，探索通過接合轉座及氯霉素篩選高效、便捷獲得啟動子文庫菌的可行性。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑：限制性內切酶BssHⅡ、NdeⅠ、NcoⅠ、T4 DNA連接酶、DNAMaker DL 2000、DL 5000、pMD18?T購自寶生物工程（大連）有限公司，Pfu酶、dNTP購自天根生化科技（北京）有限公司，FastAP、蛋白酶K購自Fermentas公司，CTAB購自Sigma公司，RNase、利福平、卡那霉素（Kan）、氯霉素、氨芐青霉素購自生工生物工程（上海）股份有限公司，質粒小量提取試劑盒、DNA小量瓊脂糖回收試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，酵母粉、蛋白胨購自北京希凱創新科技有限公司，引物由上海捷瑞生物技術有限公司合成［7，8］，見表1。

表1　引物序列Tab.1 Primer sequences

1.1.2菌株及質粒：菌株，S17?1λpir、E.coli DH5a、利福平抗性甲型副傷寒沙門氏菌CMCC50973（副甲Rif+）［9］；質粒，pSC189［9］、pACYC184（圖1）；副甲CMCC50973特異性噬菌體LSPA1［10］均為昆明理工大學基因工程與制藥實驗室保存。

1.1.3培養基及緩沖液：LB培養液：5 g酵母粉，10 g蛋白胨，10 g氯化鈉，蒸餾水1 000 mL（固體培養基添加2%的瓊脂），121℃滅菌20 min。

1.2方法

圖1　質粒pACYC184與pSC189Fig.1 pACYC184 plasmid and pSC189 plasmid

1.2.1載體pSC?CAT的構建：設計引物（表1），以pACYC184為模板，PCR擴增CAT的基因片段，上、下游分別引入BssHⅡ酶切位點。將上述基因亞克隆至pMD18?T載體，將酶切鑒定正確的載體命名為pT?CAT，酶切及測序鑒定正確后用BssHⅡ酶切pT?CAT，回收小片段插入經相同酶切并去磷酸化的pSC189載體，轉化S17?1λpir，提取質粒酶切鑒定正確后命名為pSC?CAT，重組菌命名為S17?1λpir/pSC?CAT。

1.2.2接合轉座：分別取1 mL過夜培養的S17?1λ pir/pSC?CAT與副甲Rif+，12 000 r/min離心1 min，棄上清沉淀用1 mL滅菌生理鹽水重懸，12 000 r/min離心1 min，棄上清用500 μL滅菌生理鹽水重懸。取50 μL上述副甲與100 μL S17?1λpir/pSC?CAT混合均勻后，涂至無菌0.2 μm濾膜上，正面朝上貼于無抗固體LB平板，37℃培養3 h。無菌條件下，用鑷子取出濾膜，1 mL生理鹽水洗下膜上菌苔，混勻即為洗膜液。

1.2.3副甲特異性噬菌體LSPA1驗證突變菌：取50 μL菌液涂在三抗平板上（利福平200 μg/mL、Kan 50 μg/mL、氯霉素10 μg/mL），37℃培養36 h后隨機挑出6個菌落接菌到5 mL的LB培養基中，搖瓶增菌，然后在三抗平板上劃線（利福平200 μg/mL、Kan 50 μg/mL、氯霉素10 μg/mL），待干燥后于線上滴加1滴噬菌體LSPA1原液（用滅菌的半透膜過濾，病毒滴度約為2×1010pfu），37℃培養過夜。

1.2.4熱不對稱PCR鑒定：基因組提取，分別取過夜培養的6株陽性菌5 mL，12 000 r/min離心1 min，沉淀用567 μL的TE重懸，加入30 μL的10%SDS、3 μL蛋白酶K，37℃溫育1 h；加入100 μL 5 mol/L Na?Cl，充分混勻，再加80 μL CTAB/NaCl，混勻，65℃溫育10 min；加入等體積的氯仿/異戊醇混勻，12 000 r/min離心5 min，收集上清；再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，12 000 r/min離心5 min，收集上清；加入0.6倍體積的異丙醇，旋轉混勻有白色沉淀，12 000 r/min離心10 min，沉淀用70%和無水乙醇各洗1次、晾干，沉淀用100 μL TE重懸。將6株陽性菌的基因組進行3輪不對稱PCR［11］。第一輪用非特異性上游引物CEKG2A，下游引物是轉座子的特異性引物IR2；第二輪PCR時，將第一輪PCR產物稀釋20倍作為模板，用引物Mar3、CEKG4擴增；第三輪PCR時，將第二輪PCR產物稀釋20倍作為模板，用引物IR2?60?5、CEKG4擴增。將擴增出來的條帶切膠回收，用IR2?60?5引物測序（上海生工）。擴增條件見表2。

表2　熱不對稱PCR擴增條件Tab.2 The conditions of Tail?PCR

1.2.5NCBI比對：將測序結果提交NCBI與副甲標準株ATCC9150（GI：NC_006511）進行比對分析，獲得插入位點所在的基因信息。

2　結果

2.1pT?CAT酶切鑒定結果及測序結果

pT?CAT用BssHⅡ酶切鑒定，結果見圖2，能夠切出849 bp的目的條帶，證明載體構建成功。

2.2pSC?CAT的構建及鑒定

pSC?CAT分別用NdeⅠ和NcoⅠ酶切鑒定，結果見圖3，若為正向單克隆插入，則NdeⅠ酶切后小片段為1 810 bp，NcoⅠ酶切后小片段為2 051 bp，從圖中明顯看出2個酶切條帶的大小與預期相符，證明了構建成功并且是正向的。

1，pT?CAT plasmid；2，digestion products of pT?CAT by BssHⅡ；M，DL2000 marker.圖2　重組質粒pT?CAT的酶切鑒定Fig.2 Digestion identification of recombinant pT?CAT

1，pSC?CAT plasmid；2，digestion products of pSC?CAT by NdeⅠ；3，di?gestion products of pSC?CAT by NcoⅠ；M，DL5000 marker.圖3　重組質粒pSC?CAT的酶切鑒定Fig.3 Digestinon identification of recombinant pSC?CAT

2.3副甲特異性噬菌體LSPA1驗證突變菌

將隨機挑選出來的6株突變菌在三抗平板劃線，在線上滴加噬菌體原液，37℃培養過夜；6株陽性菌滴加噬菌體處無細菌生長，說明6株陽性菌都是副甲菌（圖4）。

圖4　6株突變菌的噬菌體鑒定Fig.4 Identification of six mutational strains by phage

2.4熱不對稱PCR法鑒定轉座子插入宿主的相關基因

熱不對稱PCR第三輪結果見圖5，經過3輪PCR 后1號到4號樣品獲得明顯單一的條帶，5號與6號較為彌散，但和理論上基本一致。證明6株突變菌是轉座成功的，并篩選出了相關啟動子的位置。

圖5　6株突變菌的熱不對稱PCRFig.5 The tail?PCR of six mutational strains

2.5NCBI法分析比對轉座子插入位點基因

將測序結果與副甲標準株ATCC9150（GI：NC_ 006511）進行對比，插入位點信息見表3，插入的位點基因分別編碼膜內在蛋白，假設的三磷酸鳥苷結合蛋白，假設的保守蛋白質，HlyD?family分泌蛋白，假設的保守蛋白，假設的膜蛋白，說明副甲菌編碼的6種蛋白鄰近位置是含有啟動子的。

3　討論

啟動子位于編碼基因上游，可被RNA聚合酶識別、結合，是基因表達調控的重要順式元件之一，具有“開關”基因的作用。通過啟動子的插入或者缺失能夠有效地調控細菌的代謝，抑制致病菌的核心蛋白的表達，降低其感染效率或毒性，從而控制致病菌或病毒的感染及傳播［12］。

表3　插入位點基因列表Tab.3 List of the genes identified at the insertion site

常用的酶切插入啟動子陷阱載體篩選啟動子的方法過程復雜、操作要求高，存在背景較雜，篩選工作量大的缺點，因此本文嘗試構建攜帶無啟動子抗性基因的轉座載體，利用轉座子隨機插入副甲染色體的方法篩選啟動子。

研究中所用的pSC189含“睡美人”轉座子以及“睡美人”C9轉座酶的質粒，復制子ori R6K具有π蛋白依賴性，只在表達π蛋白菌株中復制，對無π蛋白細菌表現為自殺特性。其攜帶有的轉座片段可隨機插入細菌基因組［13］。CAT是常用的原核抗性蛋白，可使氯霉素乙酰化而失去活性，野生副甲對其敏感，因此本研究將CAT的基因克隆插入轉座片段中作為啟動子篩選標記。其轉座后如果插入位置前有適合的啟動子，則能夠表達氯霉素的抗性，由于供體菌（S17?1λpir）無利福平抗性，因此通過同時添加了利福平、卡那、氯霉素抗性平板可篩選出含有啟動子的轉座突變菌。在篩選時，篩選的非誘導型啟動子，如果施加其他額外因素，如不同pH、鹽、溫度等，可獲得誘導型啟動子，同時可以通過測定轉座突變細菌表達的CAT酶的活性，對啟動子的強度進行定量分析。

轉座子導入受體菌的辦法包括電轉和接合轉座的方法，前者轉化效率低，而后者轉化效率高且操作簡單方便。在本實驗中采用pSC?CAT轉座子質粒的供體菌（S17?1λpir）通過接合轉座副甲菌，該操作方法簡單易行，同時具有很高的效率，重復操作即可獲得大量轉座插入菌。

轉座子插入后，如何獲得插入位置基因是分析的關鍵。熱不對稱PCR可用于分析已知序列一側的未知序列，利用轉座子1段特異性引物和1條非特異性引物，隨機擴增出含目的片段一端和突變位點一端的條帶，通過測序就可以分析插入位點信息。熱不對稱PCR通常經過多輪PCR完成，本文中初始實驗選用了3條非特異性引物（CEKG2A、CEKG2B、CEKG2C），結果通過3輪擴增，其中CEKG2A擴增效果較好，因此選擇CEKG2A擴增出來的第三輪產物進行測序。從測序結果看，獲得的基因序列中均含有轉座子1段的序列，說明該片段的確實來源于轉座子插入，同時其余片段提交NCBI與標準菌株ATCC9150比對，DNA片段與標準菌株部分基因序列高度同源，進一步分析，轉座子插入鄰近位置均含有某些基因ORF的5’端非編碼區域，也就是啟動子系列的理論存在位置，說明獲得的結果是可信的。

通過本研究獲得的副甲轉座子文庫菌，為進一步研究副甲生物學特性以及致病機理奠定了良好基礎。同時pSC?CAT載體作為一種通用工具，同樣也可用于其他革蘭陰性細菌，因而具有廣泛的應用價值。

參考文獻：

［1］Venkatesh BM，Joshi S，Adhikary R，et al.Antibiogram of Salmonel?la typhi and Salmonella paratyphi A in a tertiary care hospital in 2012［J］.Indian J Pathol Micr，2013，56（4）：484-485.

［2］Jeza VT.Salmonellatyphi：from a human pathogen to a vaccine vec?tor［J］.Cell Mol Immunol，2008，5（2）：91-97.

［3］Hurley D，McCusker MP，Fanning S，et al.Salmonella?host interac?tions?modulation of the host innate immune system［J］.Front Im?munol，2014，5（481）：1-11.

［4］Kumar MS，G SV，RP，et al.Comparison of Salmonella typhi and paratyphiA occurrence in a tertiary care hospital［J］.JCDR，2013，7（12）：2724-2726.

［5］Chen XL，Zhang B，Tang L，et al.Expression and Characterization of ArgR，an arginine regulatory protein in corynebacterium crenatum ［J］.Biomed Environ Sci，2014，27（06）：436-443.

［6］許澤仰，洪愉，馮夢蝶，等.phoA為報告基因的甲型副傷寒沙門氏菌啟動子文庫的建立及初步鑒定［J］.醫學分子生物學雜志，2014，11（4）：187-191.

［7］Manoil C.Tagging exported proteins using Escherichia coli alkaline phosphatase gene fusions［J］.Meth Enzymol，2000，326：35-47.

［8］Jiao Y，Kappler A，Croal LR，et al.Isolation and characterization of a genetically tractable photoautotrophic Fe（II）?oxidizing bacterium，Rhodopseudomonas palustris strain TIE?1［J］.AEM，2005，71（8）：4487-4496.

［9］毛普加，洪愉，馮金，等.甲型副傷寒沙門氏菌噬菌體PSPA1感染宿主相關基因分析［J］.醫學分子生物學雜志，2014，11（2）：85-89.

［10］Zeng W，Mao P，Hong Y，et al.Complete genome sequence of the Salmonella enterica serovar paratyphi A bacteriophage LSPA1 iso?lated in China［J］.Genome A，2015，3（1）：e01011-14.

［11］Jacobs MA，Alwood A，Thaipisuttikul I，et al.Comprehensive trans?poson mutant library of Pseudomonas aeruginosa［J］.P Natl Acad Sci USA，2003，100（24）：14339-14344.

［12］Nie L，Thakur MD，Wang Y，et al.Regulation of U6 promoter activ?ity by transcriptional interference in viral vector?based RNAi［J］.Genomils Proteomics Bioinformatics，2010，8（3）：170-179.

［13］Chiang SL，Rubin EJ.Construction of a mariner?based transposon for epitope?tagging and genomic targeting［J］.Gene，2002，296（1?2）：179-185.

（編輯于溪）

·論著·

收稿日期：2015-01-25

通信作者：曾韋錕，E-mail：zengweikun@126.com

作者簡介：許澤仰（1990-），男，碩士研究生.

基金項目：國家自然科學基金（31160193）；云南省教育廳科學研究基金重點項目（2015Z168）；云南省應用基礎研究面上項目（2010ZC055；2012FB135）

Doi：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.01.002

中圖分類號R378.2

文獻標志碼A

文章編號0258-4646（2016）01-0007-05