青蒿素對腫瘤壞死因子α介導的REIC表達相關平滑肌增殖的影響

曹乾，陳潔，姜艷，劉雪

（中國醫科大學附屬盛京醫院1.心內科；2.急診科，沈陽110004）

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青蒿素對腫瘤壞死因子α介導的REIC表達相關平滑肌增殖的影響

曹乾1，陳潔1，姜艷2，劉雪1

（中國醫科大學附屬盛京醫院1.心內科；2.急診科，沈陽110004）

摘要目的探討青蒿素（ART）對腫瘤壞死因子α（TNF?α）介導的細胞永生化表達下調（REIC）表達相關平滑肌增殖的影響。方法將大鼠隨機分為假手術組、模型組、50 mg/kg ART組和100 mg/kg ART組。建立大鼠頸動脈球囊損傷模型，分離血管平滑肌細胞進行培養。Western blot檢測REIC表達，熒光定量PCR檢測引物。結果大鼠頸動脈球囊損傷后，REIC基因表達受到抑制，ART處理對大鼠動脈平滑肌細胞中REIC蛋白的表達影響極小。而TNF?α處理下細胞中REIC蛋白的表達水平受到顯著抑制。ART對細胞進行預處理，能夠顯著減輕TNF?α導致的REIC蛋白表達抑制。而ART處理呈劑量依賴性上調REIC的表達。結論REIC表達通過TNF?α介導參與平滑肌增殖過程，而且應用ART可以抑制平滑肌增殖過程。

關鍵詞青蒿素；大鼠頸動脈球囊損傷模型；細胞永生化表達下調；腫瘤壞死因子

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重點臨床科室診療能力建設項目（LNCCC?D10?2015）

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Effectof Artemisinineon REICExpression Related Smooth Muscle Proliferation Inducedby Tumor Necrosis Factorα

CAOQian1，CHENJie1，JIANGYan2，LIUXue1

（1.Departmentof Cardiology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang110004，China；2.Departmentof Emergency，Shengjing Hospital，China Medi?cal University，Shenyang110004，China）

Abstract Objective To explore the influence of artemisinine（ART）on smooth muscle proliferation related to reduced expression of immortal?ized cells（REIC）induced by tumor necrosis factor α（TNF?α）.Methods Rats were randomly divided into sham?operated group，model group，50 mg/kg ART group，and 100 mg/kg ART group.Balloon?damaged rat carotid artery models were established.Vascular smooth muscle cells were isolated and cultured.REIC protein and mRNA expression were detected by Western blot and fluorescent quantitation PCR.Results The expres?sion of REICgenes was suppressed when carotid arteries were balloon?damaged.Vascular smooth muscle cells，intervened with ART，minimally af?fected REICproteinexpressioninratarterialsmoothmusclecells.Whiletreatedwith TNF?α，thelevelofcellularexpressionof REICproteinwassig?nificantly restrained.Preconditioning of ART on cells would prominently ameliorate the TNF?α?induced suppression of REIC protein expression and unregulated REICexpressioninadose?dependentmanner.Conclusion REICisinvolvedintheprocessof TNF?α?inducedsmoothmuscleprolifer?ation.ARTiscapableofsuppressingproliferativeprocessofsmoothmusclecells.

Keywords artemisinine；balloon?damaged rat carotid artery；reduced expression of immortalized cells；tumor necrosis factor α

各種理化因素導致的損傷可以誘導炎癥過程、氧化應激加強，通過原癌、抑癌基因表達失調，使平滑肌增殖、遷移，進而動脈增殖加速，這是動脈粥樣硬化發生的主要機制。近幾年腫瘤領域有關細胞永生化表達下調（reduced expression in immortalized cells，REIC）研究的報道很多，但是其與動脈粥樣硬化的關系還不清楚。因此，探討REIC與平滑肌增殖關系、明確REIC表達意義及其與氧化和炎癥的關系有重要意義，可以為研究動脈粥樣硬化提供理論依據。通過干預細胞內信號轉導通路和/或調節相關基因的表達以阻斷血管平滑肌細胞增殖，可望成為治療心血管疾病的有效途徑。青蒿素（artemisinin，ART）又名黃花蒿素，是由菊科植物黃花蒿提煉出來的倍半萜內酯化合物，是治療惡性瘧原蟲所引發的瘧疾的特效藥［1］。近來研究發現，ART還具有廣譜的生物學和藥理學活性，如抗腫瘤［2］、抗炎［3］、抗氧化［4］等。本研究通過建立大鼠頸動脈球囊損傷模型以及大鼠動脈血管平滑肌細胞的培養，應用ART、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF?α）對細胞進行預處理，采用實時熒光定量PCR分析REIC基因的表達水平，Western blot分析REIC蛋白的表達水平，為上述問題提供證據支持。

1　材料與方法

1.1大鼠頸動脈球囊損傷模型的建立

選取健康SD大鼠，隨機分為假手術組、模型組、50 mg/kg ART組和100 mg/kg ART組。模型組、50 mg/kg ART組和100 mg/kg ART組大鼠行頸外動脈切開，行球囊剝脫內膜。假手術組經同樣處理但不進行球囊損傷。建模后，50 mg/kg ART組和100 mg/kg ART組大鼠每天經灌胃分別給予50 mg/kg ART和100 mg/kg ART，假手術組和模型組給予等體積的生理鹽水。

1.2大鼠動脈血管平滑肌細胞的分離與培養

處死大鼠，取動脈內膜剪成小塊，于培養瓶底部進行培養。12 h后加入完全培養基，進行細胞計數，放置到培養板中培養。第1代細胞生長至5～6 d時，進行傳代處理，收集、離心、去上清，進行細胞計數，接種培養。

模型組細胞分為6組，分別做以下處理，用于后續試驗：A組，不做任何處理；B組，用100 μmol/L ART處理細胞2 h；C組，用10 ng/mL TNF?α處理細胞24 h；D組，用25 μmol/L ART處理細胞2 h，再用10 ng/mL TNF?α處理細胞24 h；E組，用50 μmol/L ART處理細胞2 h，再用10 ng/mL TNF?α處理細胞24 h；F組，用100 μmol/L ART處理細胞2 h，再用10 ng/mL TNF?α處理細胞24 h。

1.3蛋白質抽提測定

1.3.1抽提蛋白及定量：制備標準曲線后，將抽提的蛋白待測樣本1 μL與19 μL PBS緩沖液混勻，加入各孔中吹打混勻。以標準蛋白濃度及對應吸光值繪制標準曲線，通過回歸方程計算樣本蛋白濃度。

1.3.2SDS?PAGE：根據目的蛋白分子量選用對應濃度的聚丙烯酰胺凝膠。先后灌入分離膠、濃縮膠，封口，等待上樣。稀釋蛋白樣品后在沸水浴中煮沸，制成上樣液。電泳槽每孔加入20 μL電泳上樣液進行電泳。

1.3.3轉印封閉，孵育一抗、二抗：電泳結束后，剝落凝膠。在轉印夾負極一側鋪海綿、濾紙、凝膠，之后浸于轉印緩沖液中的PVDF膜，膜的正面與凝膠接觸，在PVDF上面鋪上濾紙和海綿，進行轉印。轉印結束后取出PVDF膜，TTBS沖洗后，浸入脫脂奶粉溶液中。用脫脂奶粉稀釋抗體，制成抗體工作液，倒入雜交袋中，放入PVDF膜，進行抗體孵育。同樣進行二抗孵育。

1.3.4ECL底物發光，抗體剝脫封閉：取出孵育二抗后的PVDF膜進行曝光后加入剝脫液，再浸入脫脂奶粉溶液中。

1.3.5孵育內參抗體、二抗：同樣方法孵育內參抗體及二抗后ECL底物發光。

1.3.6結果分析：將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統（Gel?Pro?Analyzer軟件）分析目標條帶的光密度值。

1.4熒光定量PCR

1.4.1總RNA提取：樣本中加入裂解液、氯仿，振蕩離心，吸附柱吸附，離心。

1.4.2反轉錄：將RNA樣本進行反轉錄以得到對應的cDNA，樣本上樣量（μL）與ddH2O使用量（μL）如下：A組，3.8、6.7；B組，5.2、5.3；C組，4.5、6.0；D組，3.4、7.1；E組，3.3、7.2；F組，5.5、5.0。在無核酸酶的離心管中加入反應混合物，混勻，加熱終止反應。以上步驟由PCR儀完成，最后得到20 μL cDNA樣本。

表1　引物序列表Tab.1 Oligonucleotide primer sets for real?time PCR

1.4.3實時熒光定量分析：稀釋引物，引物信息見表1。反應體系為cDNA模板1 μL；上下游引物（10μmol/L）各0.5 μL；SYBR GREEN mastermix 10 μL；用ddH2O補足至20 μL。分別以不同反應條件反應40次。

1.5免疫熒光染色及鏡檢

固定細胞爬片，將爬片倒扣在載玻片上封片。于激光共聚焦顯微鏡下觀察。于鏡下（400×）拍照。1.6 REIC表達和引物序列檢測

1.6.1Western blot檢測REIC表達：一抗為REIC抗體，內參抗體為β?actin抗體，二抗為羊抗兔IgG?HRP。

1.6.2熒光定量PCR檢測引物序列：REIC（NM_ 138519.2），F，CAACTACCACAACGAGACCAA；R，ATGGCTCTTCTTGCCTTCT。β?actin（NM_031144.3），F，GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC；R，GGCCG?GACTCATCGTACTCCTGCTT。

1.7RNA濃度測定

RNA提取后利用紫外分光光度計用實時熒光定量分析方法（2-△△CT方法）對提取的RNA濃進行測定。結果提示A組～F組核酸濃度（ng/μL）分別為263.5、193.5、220.7、291.5、304.6、182.1，A組～F組吸光度比值（260/280）分別為1.82、1.83、1.93、1.96、1.99、1.81。本研究中每種樣本每個基因進行復孔平行實驗，舍去誤差較大的數值，取剩余數值的平均值作為最終實驗保留數據。

1.8統計學分析

采用GraphPad Prism軟件進行統計學分析，計量資料以x±s表示，應用Bonferroni法進行多重比較，應用方差分析進行單因素分析。P< 0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1大鼠動脈平滑肌細胞顯微形態學觀察及鑒定

細胞形體多呈長梭形，核大，有明顯的肌絲纖維，細胞呈典型“峰－谷”狀生長。見圖1。

A，×100；B，×400.圖1　大鼠動脈平滑肌細胞形態觀察Fig.1 Morphology of rat arterial smooth muscle cells

免疫熒光雙標染色顯示，與細胞長軸平行的綠色部分為α平滑肌肌動蛋白（α?smooth muscle actin，α?SMA），藍色部分為細胞核。胞質中α?SMA呈陽性表達，證明分離的細胞為大鼠動脈平滑肌細胞。見圖2。

A，DAPI；B，α?SMA；C，merged.圖2　大鼠動脈平滑肌細胞免疫熒光鑒定×400 Fig.2 Immunofluorescence identification of rat arterial smooth muscle cells×400

2.2實時熒光定量PCR分析REIC基因的表達水平

與假手術組比較，模型組大鼠頸動脈中REIC mRNA水平顯著降低（P< 0.01）。50 mg/kg ART組及100 mg/kg ART組大鼠頸動脈中REIC的表達與模型組比較顯著升高（P< 0.05）。

模型組中，B組細胞中REIC基因的表達無顯著變化，C組細胞中REIC基因的表達受到顯著抑制。D組、E組及F組中可以觀察到，不同濃度的ART對細胞進行預處理，能夠呈劑量依賴性減輕TNF?α對REIC基因表達的抑制。見圖3。

2.3Western blot分析REIC蛋白的表達水平

與假手術組相比，模型組大鼠頸動脈中REIC蛋白水平顯著降低（P< 0.01）。在50 mg/kg ART組及100 mg/kg ART組大鼠頸動脈中，REIC蛋白水平的表達與模型組相比顯著升高（P< 0.05）。見圖4。

圖4　REIC蛋白的表達水平Fig.4 REIC protein expression level

模型組中，B組細胞中REIC蛋白的表達無顯著變化，C組細胞中REIC蛋白的表達水平受到顯著抑制。D組、E組及F組中可以觀察到，ART能夠顯著減輕TNF?α導致的REIC蛋白表達抑制，且ART的作用呈劑量依賴性。見圖5。

圖5　REIC蛋白的表達水平Fig.5 REIC protein expression level

3　討論

動脈粥樣硬化是一種主要侵害大、中動脈，使血管內膜增厚、變硬、管腔狹窄的慢性動脈疾病。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的活化、增殖和遷移是動脈粥樣硬化發展的必要條件，有炎性反應參與，有研究表明可能是通過上調炎性細胞因子及下調抗炎細胞因子的表達參與動脈粥樣硬化的形成［5］。在生理狀態下，VSMCs合成分泌膠原等細胞外基質維持血管的正常結構和功能。但是粥樣斑塊形成早期，VSMCs從血管中膜遷移至內膜，進而增殖并發生表型變化，合成分泌細胞外基質、釋放多種生長因子，如TNF?α等［6，7］。動脈粥樣硬化的平滑肌增殖過程，與腫瘤類似。某種基因低表達可以促使細胞永生化，即抑癌基因。一些原癌、抑癌基因由于參與調控內皮細胞、平滑肌增生與凋亡，在動脈粥樣硬化中也起到關鍵作用。Tsuji等［8］從幾種永生化細胞系中發現一段新的基因序列REIC表達明顯下調。REIC基因在永生化的細胞系和部分腫瘤細胞系中被發現，在心、腦和脊髓高表達。近年來對REIC基因在腫瘤方面有所研究，認為與新生血管數量、平滑肌細胞明顯增殖、內皮細胞功能有關。但是REIC基因與動脈粥樣硬化的關系少有研究。因此研究調控VSMCs的增殖和遷移的機制，尋找能夠調控VSMCs的增殖和遷移的藥物，對于開發新的有效的動脈粥樣硬化的治療方法具有重要意義。

血管壁受損是導致血管平滑肌細胞增殖的起始原因。損傷刺激通過細胞內的信號轉導可引起許多原癌基因的表達和細胞因子生成，使血管平滑肌細胞增殖和凋亡的平衡被打破，導致血管平滑肌細胞過度增殖［9］。本研究中與假手術組相比，模型組大鼠頸動脈中REICmRNA水平顯著降低，而在50 mg/kg ART組及100 mg/kg ART組大鼠頸動脈中，REIC的表達比模型組顯著升高。反映球囊損傷后，REIC基因表達受到抑制，平滑肌增殖明顯，而ART處理能夠呈劑量依賴性上調REIC的表達，對抗增殖。對于培養的大鼠動脈平滑細胞，100 μmol/L ART處理后無論REIC的基因表達還是蛋白表達并無顯著變化，可能與缺少作用關鍵環節有關。而10 ng/mL的TNF?α能夠顯著抑制細胞中REIC基因的表達水平和蛋白合成。使用25 μmol/L、50 μmol/L及100 μmol/L ART對細胞進行預處理，能夠呈劑量依賴性減輕TNF?α對REIC基因表達和蛋白合成的抑制。說明在平滑肌增殖過程中TNF?α起到重要作用，對于大鼠損傷動脈的平滑肌增殖，不同濃度ART通過TNF?α介導的REIC表達抑制起到抑制受損的平滑肌增殖作用。

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（編輯陳姜）

［1］Ross R.Atherosclerosis?an inflammatory disease［J］.N Engl J Med，

收稿日期：2015-05-13

作者簡介：曹乾（1975-），男，副教授，碩士.

基金項目：遼寧省自然科學基金（201202275）；遼寧省省直醫院改革

Doi：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.01.006

中圖分類號R331.3

文獻標志碼A

文章編號0258-4646（2016）01-0026-05