塞來昔布對2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪肝病相關的胰島素抵抗的影響

張亞杰，靳爽，姜寧，田豐

（中國醫科大學附屬盛京醫院第一消化內科，沈陽110004）

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塞來昔布對2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪肝病相關的胰島素抵抗的影響

張亞杰，靳爽，姜寧，田豐

（中國醫科大學附屬盛京醫院第一消化內科，沈陽110004）

摘要目的探討選擇性環氧合酶2（COX?2）抑制劑塞來昔布對2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪肝病相關的胰島素抵抗的影響。方法雄性SD大鼠36只，隨機等分為對照組、模型組、模型+塞來昔布組。造模結束前1周行胰島素耐量試驗，造模結束時（共12周）取血清、肝臟組織及附睪脂肪組織。檢測血清葡萄糖、胰島素等相關生化指標；HE染色觀察肝臟和脂肪組織病理改變；Western blot檢測肝臟和附睪脂肪組織中COX?2蛋白的表達。結果與對照組相比，模型組血清葡萄糖、胰島素、總膽固醇、低密度膽固醇水平、肝內甘油三酯、肝內膽固醇水平均顯著高于對照組；應用塞來昔布治療后，上述生化指標較模型組均有顯著下降。模型組胰島素抵抗指數顯著高于對照組，胰島素敏感性指數及胰島素耐量試驗顯示模型組胰島素敏感性下降，應用塞來昔布治療后胰島素敏感性較模型組顯著改善。模型組大鼠肝指數較模型+塞來昔布組顯著升高，而模型組大鼠附睪脂肪組織質量及其相對質量（EAW/BW）顯著少于模型+塞來昔布組。HE染色結果顯示，模型組肝細胞脂肪變性評分顯著高于對照組，應用塞來昔布治療后模型+塞來昔布組肝細胞脂肪變性程度減輕，同時附睪脂肪組織脂肪細胞面積較模型組增加。Western blot結果顯示模型組中肝組織和脂肪組織COX?2相對蛋白表達量顯著高于對照組和模型+塞來昔布組。結論塞來昔布具有改善2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪肝病相關的胰島素抵抗作用，其機制可能與抑制肝臟組織和脂肪組織的COX?2表達有關。

關鍵詞塞來昔布；非酒精性脂肪肝病；胰島素抵抗；環氧合酶2

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Effectof Celecoxibonthe Insulin Resistanceof Non?alcoholic Fatty Liver Diseasein Type2 Diabetes Mellitus Rats

ZHANGYa?jie，JINShuang，JIANGNing，TIANFeng

（Departmentof Gastroenterology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang110004，China）

Abstract Objective Toinvestigatetheeffectofselective COX?2inhibitorcelecoxibontheinsulinresistanceofnon?alcoholicfattyliverdiseasein ratswithtype2diabetesmellitus.Methods Atotalof36male SDratswererandomlydividedintocontrolgroup，modelgroup，andmodel+celecox?ib group（n= 12）.Insulin tolerance test（ITT）was conducted at the 11th week.All rats were sacrificed at the 12th week.The blood，liver and adi?posetissueswerecollected.Relatedbiochemicalindexesincludingserumglucoseandinsulinandsoonweredetected.Liverandadiposetissuepath?ological changes were observed by HE staining.The expression of COX?2 at protein level in liver and adipose tissues were respectively detected by Western blot.Results The level of serum glucose，insulin，total cholesterol and low density cholesterol in model group were significantly higher than those in control group.The level of hepatic triglycerides and cholesterol in model group were significantly higher than those in control group.Af?tertheapplicationofcelecoxib，thebiochemicalindexesweredroppedsignificantlyinmodel+celecoxibgroup.Comparedwithcontrolgroup，HOMA?IR was significantly higher in the model group.Insulin sensitivity index（ISI）and ITT suggested the decreased insulin sensitivity in model group.In?sulin sensitivity was significantly improved after the application of celecoxib.The liver index was higher and the EAW/BW was lower in model group compared with the model+celecoxib group.The HE staining results showed that hepatocyte steatosis in model group was more serious than control group.Celecoxib significantly attenuated hepatocyte steatosis and increased the adipose cells area of EAW in the model+celecoxib group.Western blot indicated that relative COX?2 protein levels in liver and adipose tissue of the model group was significantly higher than that in control group and the model+celecoxib group.Conclusion Celecoxib improved the insulin resistance of non?alcoholic fatty liver disease in type 2 diabetes mellitusrats，anditsmechanismmayberelatedtotheinhibited COX?2expressioninliverandadiposetissue.

Keywords celecoxib；non?alcoholic fatty liver disease；insulin resistance；cyclooxygenase?2

非酒精性脂肪肝病（non?alcoholic fatty liver diease，NAFLD）的患病率呈明顯上升趨勢，但其發病機制尚不清楚。目前普遍認為胰島素抵抗（insu?lin resistance，IR）可造成肝臟、脂肪組織的脂類代謝不平衡：脂肪組織脂解增強，肝臟攝取并合成過多甘油三酯，加重肝臟細胞內炎性反應和氧化壓力［1］。研究［2～5］發現環氧合酶2（cyclooxygenase?2，COX?2）在代謝綜合征中發揮重要作用。選擇性COX?2抑制劑塞來昔布能改善肥胖大鼠IR，減弱IR大鼠的氧化應激，改善肝臟脂肪變性。但COX?2及其抑制劑是否對2型糖尿病大鼠NAFLD相關的IR和脂質代謝發揮作用，相關研究甚少。本研究建立在2型糖尿病初期IR階段的NAFLD大鼠模型，檢測肝臟和脂肪組織中COX?2的表達以及肝臟-脂肪組織中的脂質含量的變化，并初步探討塞來昔布對2型糖尿病大鼠NAFLD相關的IR的影響。

1　材料與方法

1.1材料

SPF級雄性SD大鼠36只（中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心提供）。鏈脲佐菌素（美國Sig?ma公司），塞來昔布（美國輝瑞公司），肝內甘油三酯、膽固醇檢測試劑盒（北京北化康泰臨床試劑有限公司），COX?2一抗（Santa Cruz公司），胰島素放射免疫試劑盒（北京原子高科股份有限公司）。

1.2模型的建立與處理

建立2型糖尿病大鼠NAFLD模型SPF級雄性SD大鼠36只，5～6周齡，體質量（body weighy，BW）（200±20）g。適應性喂養1周。所有大鼠隨機等分為模型組（n=12）、模型+塞來昔布組（n=12）和對照組（n=12）。模型組和模型+塞來昔布組：予高糖高脂飼料（10%豬油，20%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽，66.5%基礎飼料；41.4 kJ/kg）喂養；對照組予基礎飼料（25 kJ/kg）喂養。4周后予禁食12～16 h，模型組和模型+塞來昔布組均一次性腹腔注射0.5% STZ（30 mg/kg），對照組腹腔注射等體積的檸檬酸?檸檬酸鈉緩沖液。注射1周后尾靜脈取血測隨機血糖，若血糖≥16.7 mmol/L且穩定2周為造模成功的2型糖尿病大鼠模型。STZ注射4周后，模型+塞來昔布組予以塞來昔布［10 mg/（kg·d）］溶于生理鹽水中灌胃4周，模型組及對照組均予以等體積生理鹽水灌胃4周。各組大鼠在喂養第11周時進行胰島素耐量試驗（insulin tolerance test，ITT），第12周造模結束。取材時，10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉，腹主動脈采血，肝臟、附睪脂肪組織（epididymal adipose tissue，EA）取下后稱重并用4%多聚甲醛固定或于-80℃冰箱凍存。大鼠腹主動脈采血后，將裝有1 mL全血的1.5 mL EP管放入離心機中，1 500 r/min，4℃離心20 min，收集上清。

1.3血清生化指標檢測

用全自動生化分析儀（ci16200）檢測血糖、血清甘油三酯和膽固醇。放射免疫法測定血清胰島素水平。評估胰島素敏感性：穩態模型評估胰島素抵抗指數（homeostasis model assessment of insulin resis?tance，HOMA?IR）=空腹胰島素水平（IU/mL）×空腹血糖水平（mmol/L）/22.5；胰島素敏感性指數（insu?lin sensitivity index，ISI）=1/空腹胰島素水平（IU/mL）×空腹葡萄糖水平（mmol/L）。

1.4病理學檢測

大鼠肝組織、EA分別固定后，常規脫水、透明、浸蠟、包埋、石蠟切片，常規脫蠟至水，蘇木素染色，水洗，伊紅染色，再次水洗，常規脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。HE染色后，顯微鏡下觀察脂肪細胞大小形態變化，Image?Pro Plus 7.0software圖像分析系統分析脂肪細胞面積，作為評價脂肪細胞大小的指標。

1.5大鼠肝內脂肪含量檢測

向100 mg肝組織中加入0.1 mL氯仿和0.2 mL甲醇，氯仿甲醇水比例為（1∶2∶0.8），充分剪碎勻漿。然后向勻漿液中再加入0.1 mL氯仿充分混勻30s，再加入0.1 mL蒸餾水充分混勻30s，此時氯仿甲醇水比例為（2∶2∶1.8），渦旋混勻后，將勻漿液3 000 r/min離心20 min，4℃，取下層氯仿層，脂質即位于氯仿層。分別用甘油三酯和膽固醇試劑盒37℃反應30 min。全自動多功能酶標儀測定500 nm處吸光度值，以空白管調零，計算每孔的甘油三酯和膽固醇濃度。

1.6Western blot方法檢測COX?2蛋白表達

肝組織約50 mg、脂肪組織50 mg分別置于EP管內，分別加入500 μL的RIPA裂解液（其中含1%體積的PMSF），勻漿機勻漿，離心后提取蛋白。BCA法測蛋白濃度，蛋白上樣量約60 μg。配制8%的聚丙烯酰胺凝膠，煮樣后電泳、轉膜、封閉（5%脫脂奶粉）、一抗4℃過夜（COX?2為1∶400稀釋；GAPDH 為1∶10 000稀釋），洗膜1 h，加入二抗，室溫孵育2 h后電化學發光，應用Quantity One軟件計算灰度值。

1.7統計學分析

統計數據以x±s表示，應用SPSS 17.0統計軟件，兩兩比較采用t檢驗，P< 0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠不同部位質量及相關指數的比較

模型組大鼠BW顯著低于對照組，但其肝濕重及肝指數顯著高于對照組（P< 0.01）；而模型組大鼠附睪脂肪質量（epididymal adipose tissue weight,EAW）和EAW/BW顯著低于對照組（P< 0.01）。與模型組相比較，模型+塞來昔布組大鼠的肝指數明顯減少,EAW和EAW/BW明顯增加（P< 0.01）。見表1。

表1　各組大鼠BW、肝濕重、肝指數、EAW和EAW/BW的比較Tab.1 Comparison of body weight，liver weight，liver index，EAW，and EAW/BW between different groups of rats

2.2各組大鼠血清學結果的比較

與對照組相比，模型組大鼠血清相關生化指標葡萄糖、甘油三酯、膽固醇、低密度-膽固醇水平均顯著高于對照組（P< 0.01）。應用塞來昔布治療后，可見模型+塞來昔布組血清葡萄糖、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白-膽固醇水平均顯著低于模型組（P< 0.01）。但高密度脂蛋白-膽固醇水平各組之間未見明顯統計學差異。見表2。

表2　各組大鼠血清學結果的比較Tab.2 Comparison of serum indexes among each group

2.3各組大鼠胰島素抵抗情況的評估及肝內脂質含量情況的比較

模型組大鼠血清胰島素水平、顯著高于對照組（P< 0.01），而ISI、EA中的脂肪細胞面積顯著低于對照組（P< 0.01）。模型+塞來昔布組大鼠血清胰島素水平、HOMA-IR、肝內甘油三酯含量及肝內膽固醇含量顯著低于模型組（P< 0.01），而ISI、EA中的脂肪細胞面積顯著高于模型組（P< 0.01）。見表3。

表3　各組胰島素抵抗的相關參數及肝內脂質含量情況的比較Tab.3 The comparison of insulin resistance parameters and hepatic lipid content in each group

圖1　胰島素耐量試驗的結果Fig.1 The result of insulin tolerance test

圖2　各組大鼠肝臟組織和脂肪組織的HE染色結果Fig.2 HE?stained liver and adipose tissue

2.4各組大鼠病理學檢查結果

HE染色顯示對照組大鼠肝組織結構完整，肝小葉結構正常，肝細胞排列成肝索，在中央靜脈周圍呈放射狀分布，細胞呈多邊形；模型組和模型+塞來昔布組顯示肝細胞體積增大，脂肪變以大泡性為主，細胞核被擠向一邊，彌漫累及整個肝小葉，部分可見小葉內炎癥細胞浸潤和散在點灶狀壞死。應用NAFLD活動度積分（NAS）評價肝細胞脂肪變性程度［6］，結果顯示模型組肝細胞脂肪變性程度（3.00±0.00）顯著高于模型+塞來昔布組（1.89± 0.60，P< 0.05）。HE染色顯示與對照組相比，模型組大鼠脂肪組織細胞形態不規則，排列紊亂，可見炎性細胞浸潤，其脂肪細胞面積顯著小于對照組。應用塞來昔布治療后，模型+塞來昔布組脂肪細胞排列趨向規則，其脂肪細胞面積顯著大于模型組（P< 0.05），見圖2。

2.5各組大鼠肝組織和脂肪組織中COX?2的West? ern?blot結果

與對照組相比，模型組中肝組織和脂肪組織COX?2的蛋白相對表達量分別為3.24±0.22和2.91± 0.15，較對照組（分別為1.00±0.13和1.02±0.21）顯著升高（P均<0.01）。應用塞來昔布治療后，模型+塞來昔布組中肝組織和脂肪組織COX?2蛋白相對表達量分別為1.28±0.12和1.19±0.13，較模型組顯著下降（P均<0.01），見圖3。

圖3　各組大鼠肝臟組織和EAW中COX?2的蛋白表達結果Fig.3 The expression of COX?2 in liver and adipose tissues

3　討論

NAFLD是一種代謝綜合征，其危險因素包括：高脂肪高熱量膳食結構、多坐少動的生活方式、肥胖、高血壓、血脂紊亂、2型糖尿病等。目前有關NAFLD的形成發展機制尚不明確。但IR被公認為NAFLD的始動和中心環節。IR一方面可通過加強脂肪組織脂解作用增加肝臟攝取脂質，另一方面高胰島素血癥可阻礙脂肪酸的β氧化，進而加劇脂質過氧化物的產生和氧化應激反應，形成惡性循環。

COX?2介導的炎性反應參與到眾多病理過程中。研究［4，5］發現，COX?2介導的炎性反應能夠促進NAFLD的發生發展，而COX?2抑制劑具有改善肝臟脂肪性炎性反應，避免病變進展的作用。Chen等［7］研究發現在高脂飲食大鼠模型中塞來昔布能夠改善肝臟脂肪變性程度，同時能改善肝臟炎性反應程度。近來研究發現COX?2與IR密切相關，有研究［2，3，8］指出在IR的肥胖大鼠脂肪組織中COX?2呈現高表達；而塞來昔布能改善肥胖大鼠IR，降低肝內甘油三酯水平，減弱IR大鼠的氧化應激狀態及肝內脂質過氧化反應。但COX?2及其抑制劑塞來昔布對NAFLD中IR作用如何，相關研究尚不明確。

本研究建立高糖高脂飼料喂養的2型糖尿病大鼠模型，喂養12周后成功建立NAFLD模型。檢測胰島素水平發現：與對照組相比，模型組血清胰島素水平顯著升高。為進一步評價IR情況，計算得出模型組HOMA?IR顯著升高，ISI顯著下降。ITT顯示模型組在注入胰島素后仍呈現高血糖水平，血糖改善趨勢平緩。上述結果均說明模型組IR的存在。與模型組相比，模型+塞來昔布組的血清胰島素水平和HOMA?IR均有明顯下降，ISI明顯上升；同時ITT可見胰島素注射后隨時間延長模型+塞來昔布組整體血糖改善水平優于模型組。上述實驗結果均說明塞來昔布能夠改善2型糖尿病大鼠NAFLD病變中的IR狀態。

為進一步研究塞來昔布對NAFLD病變中脂質代謝的影響，本研究分別檢測了肝臟和脂肪組織中脂肪含量。與對照組相比，模型組的肝指數以及肝組織內甘油三酯和膽固醇水平均有顯著升高；應用塞來昔布治療后模型+塞來昔布組肝指數以及肝組織內甘油三酯和膽固醇水平均明顯下降。模型組的EAW及EAW/BW較對照組均有顯著下降；應用塞來昔布治療后模型+塞來昔布組大鼠BW增加，EAW及EAW/BW均較模型組上升，同時HE染色結果發現模型+塞來昔布組的脂肪細胞面積較模型組顯著上升。上述結果說明塞來昔布具有減輕肝臟脂質聚集的作用，同時增加了EA脂質的存儲，提示了塞來昔布可能通過減少脂肪組織脂解作用，從而降低脂質從脂肪組織向肝組織的“轉移”。

為進一步研究塞來昔布改善IR和脂質代謝的作用機制，我們通過Western?blot的方法檢測了肝組織和脂肪組織中COX?2的表達情況。結果發現模型組的肝組織和脂肪組織中COX?2蛋白表達情況均明顯增高，應用塞來昔布治療后即模型+塞來昔布組的COX?2蛋白表達水平明顯下降，上述結果說明塞來昔布對肝臟組織和脂肪組織COX?2的表達均起到抑制作用，進一步提示塞來昔布可能通過調節肝組織和脂肪組織COX?2的表達來調節機體的IR狀態。

總之，本研究發現塞來昔布可以改善NAFLD病變的IR，且能夠降低肝內脂質含量，促進脂肪組織儲脂，其機制極有可能是通過調節肝組織和脂肪組織COX?2的表達來實現的。COX?2是否是肝臟組織和脂肪組織之間的“橋梁”有待進一步研究。

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（編輯于溪）

收稿日期：2015-05-04

通信作者：田豐，E-mail：tianfeng@sj?hospital.org

作者簡介：張亞杰（1986-），女，醫師，碩士.

基金項目：遼寧省科學技術計劃項目（2010225034）

Doi：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.01.009

中圖分類號R575.5

文獻標志碼A

文章編號0258-4646（2016）01-0039-06