GPI-B7-1錨定腎癌細胞膜對細胞毒性T淋巴細胞殺傷自身腫瘤的促進作用

葛蕙心，張一兵，李慧忠，暢繼武

(1貴州省腫瘤醫院·貴州醫科大學附屬醫院，貴陽550003；2華北煤炭醫學院；3徐州醫學院附屬醫院；4天津醫科大學第二附屬醫院)

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GPI-B7-1錨定腎癌細胞膜對細胞毒性T淋巴細胞殺傷自身腫瘤的促進作用

葛蕙心1，張一兵2，李慧忠3，暢繼武4

(1貴州省腫瘤醫院·貴州醫科大學附屬醫院，貴陽550003；2華北煤炭醫學院；3徐州醫學院附屬醫院；4天津醫科大學第二附屬醫院)

目的探討糖基磷脂酰肌醇(GPI)-B7-1錨定腎細胞癌(RCC)細胞膜能否提高細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對自身腫瘤的殺傷能力。方法 取出本實驗室凍存于液氮罐中的經轉基因高表達GPI-B7-1 的CHO/DHFR-細胞，再從該CHO/DHFR-細胞上洗脫目的蛋白GPI-B7-1，并進行分離純化，Western blotting法檢測活性。建立腎癌細胞系CG-6327。將CTL分別與GPI-B7-1-CG-6327細胞膜、CG-6327細胞膜、GPI-B7-1-CHO/DHFR-細胞膜作用24 h，此時得到被三種不同物質活化的CTL細胞，再設單純體外培養的CTL作為對照，分別將上述四種CTL細胞加入到已接種有CG-6327細胞的96孔板中，進行24 h殺傷試驗,MTT法測定CTL的殺傷活性。結果 經GPI-B7-1-CG-6327細胞膜活化的CTL細胞殺傷活性(A值)與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，其他幾種物質活化的CTL細胞殺傷活性與對照組比較，P均>0.05。結論 通過基因重組方法表達的GPI-B7-1錨定蛋白可被轉移并錨定在RCC細胞膜表面提供第二刺激信號，GPI-B7-1錨定后的具有雙刺激信號的RCC細胞膜對于CTL的活化有增強作用。

腎腫瘤；糖基磷脂酰肌醇-B7-1；細胞毒性T淋巴細胞；腫瘤免疫

腎細胞癌(RCC)是泌尿系統中第二常見惡性腫瘤，占成人全部惡性腫瘤的2%～3%，占腎臟原發性惡性腫瘤的85%～90%，20%初診時已轉移，30%術后發生轉移[1]，且其發病率以每年2%的增長率升高[2]。RCC是免疫原性很強的腫瘤,免疫過程主要是由T淋巴細胞介導[3]，而T淋巴細胞的活化需要兩個信號系統，第一信號是由T淋巴細胞受體(TCR)與抗原肽-MHC復合物相結合所提供；第二信號是由共刺激分子或輔助分子通過與T細胞上相應受體結合而傳遞[4]。RCC缺乏共刺激信號的表達，使T淋巴細胞進入無反應狀態或程序性死亡，出現RCC的免疫逃逸。因此,RCC術后的患者迫切需要有效的全身治療。RCC對放療、化療及激素治療不敏感,單用或聯合應用的應答率都不足10%。已經發現和證實許多免疫分子在RCC的治療中有一定的發展前景。隨著細胞表面工程學的發展,GPI-B7-1蛋白可錨定于腫瘤細胞表面,從而提供共刺激信號,加強機體對腫瘤的免疫殺傷[5]。2007年1月～2009年7月，本實驗中我們利用前期本實驗室構建成功的轉基因高表達GPI-B7-1的CHO/DHFR-細胞提取GPI-B7-1，將其再次錨定于自身RCC細胞膜上，從而活化自身T淋巴細胞，觀察細胞毒性T淋巴細胞(CTL)殺傷自身腫瘤的作用。

1　材料與方法

1.1材料細胞系：細胞二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷型轉基因中國倉鼠卵巢細胞(CHO/DHFR-)高表達GPI-B7細胞株及非轉染的CHO/DHFR-細胞系、RCC細胞系CG-6327由本實驗室提供。試劑：RPMI-1640、DMEM、MTX、HEPES購自GIBCO公司，胎牛血清購自天津市北晨盛達生物制品廠，G418購自Solarbio公司，FITC標記的鼠抗人CD80單克隆抗體購自CALTAG公司，FITC標記的小鼠抗人IgG、MTT購自SIGMA公司，淋巴細胞分離液、IL-2、IL-4、GM-CSF、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、二甲基亞砜、EDTA、L-谷氨酰胺等均購自國內生化試劑公司，PMSF、TritonX-100均購自于SIGMA公司，低分子蛋白MARKER購自Amersham公司，Tris堿、甘氨酸、聚丙烯酰胺，N,N-亞甲雙丙烯酰胺、SDS、TEMED、硫酸銨均購自北京鼎國公司，考馬斯亮藍、溴酚藍購自SIGMA公司。

1.2GPI-B7-1在CHO/DHFR-細胞表達的觀察將凍存于液氮罐中的經轉基因高表達GPI-B7-1的CHO/DHFR-細胞取出，用90% DMEM、10%胎牛血清、600 μg/mL G418的完全培養液進行培養，待細胞生長良好后，逐漸向完全培養液中加入MTX，加壓培養，促使GPI-B7-1持續高表達。大量擴增細胞,待細胞長出單層，用無血清培養液洗滌2次后懸浮細胞為1×106/mL，取FITC標記的CD80單抗5 μL加入標記好的細胞管中，4 ℃濕盒中溫育30 min，0.01%疊氮鈉-PBS洗滌3次，點片，加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察GPI-B7-1在細胞表面的表達。

1.3GPI-B7的洗脫、鑒定及提取 大量培養擴增轉染后的CHO/DHFR-細胞，用PBS洗滌1次，20 mmol/L EDTA-PBS室溫下作用30 min，低速離心收集細胞。細胞在裂解緩沖液(5 mmol/L Tris pH 7.0,2 mmol/L MgCL,0.1 mmol/L EDTA,1 mmol/L PMSF,2 μg/mL Aprotinnin,2 μg/mL Leupeptin,1 μg/mL pepstainA) 4 ℃振搖1 h。11 000 g 4 ℃離心20 min可沉降膜。用裂解緩沖液洗滌1次，然后溶于提取緩沖液(1% Triton X-100，10 mmol/L Tris pH 7.4，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF,2 μg/mL Aprotinin,2 μg/mL Leupeptin,1 μg/mL pepstainA)4 ℃振搖1 h。11 000 g 4 ℃離心20 min可去除膜成分，留取上清液。用飽和硫酸銨沉淀法沉淀蛋白，靜置1.5 h時，在PBS中4 ℃透析24 h。用蛋白濃縮柱濃縮蛋白。GPI-B7-1蛋白經去離子去污劑洗脫后,用PBS透析24 h，SDS-PAGE電泳，經電轉，蛋白條帶完全轉移到醋酸纖維膜上，進行Western blotting檢測，在66 kD附近有一條淺褐色條帶。證明可以得到較純的GPI-B7-1，其量>10 μg/mL。

1.4 RCC細胞的培養及建系 取天津醫科大學第二附屬醫院1例男性RCC手術患者的腎癌組織一塊,大小約1 cm×1 cm，直接組織塊法進行原代培養。培養5～7 d后可見組織塊周圍有細胞爬出，培養2～4周可形成單層細胞，細胞呈梭形，折光性好，胞質豐富，胞核大可見核仁。予以傳代和凍存,細胞爬片，行HE染色鑒定及透射電鏡下觀察,細胞呈圓形，表面可見微絨毛，核偏位，不規則，為常染色質，未見核仁。胞質內可見大量有膜包圍的空泡，空泡內為微管、髓樣結構及不定形物。近細胞邊緣處的胞質內可見線粒體、微管、微絲及核蛋白體，說明細胞增殖良好，可用于傳代。傳代培養，F1大量凍存，以后間隔數代凍存1次，進行細胞系鑒定和指標檢測，建立RCC細胞系，命名為CG-6327。

1.5 淋巴細胞分離、培養 取上述該患者5 mL靜脈血，無菌條件下放入裝有肝素的培養瓶中，帶入超凈臺，進行淋巴細胞分離。取10 mL離心管加入淋巴細胞分離液4.5 mL，再加入靜脈血5 mL，2 500 r/min離心15 min。輕輕吸取白色云霧狀淋巴細胞層，移入一裝有DMEM培養液5 mL的離心管中。1 500 r/min離心15 min。離心后棄上清，管底可見白色沉淀，將沉淀懸于含有IL-2、IL-4、GMCSF的DMED培養液中，移入50 mL培養瓶中進行培養。

1.6不同RCC細胞膜作用下的CTL殺傷能力檢測取CG-6327細胞作為靶細胞，以每孔1×104個細胞接種96孔板，將分別經過GPI-B7-1-CG-6327細胞膜、CG-6327細胞膜、GPI-B7-1-CHO/DHFR-細胞膜作用的CTL及未處理的CTL分別按CTL∶CG-6327為10∶1的效靶比加入96孔板中，每組設12個復孔，不加CTL的CG-6327作為對照，進行24 h殺傷試驗。作用24 h后，換液，每孔加入RPMI1640基礎培養基100 μL，用MTT法測定CG-6327的活性。

2　結果

2.1GPI-B7-1融合基因的表達產物鑒定經基因轉染后的GPI-B7-1 CHO/DHFR-細胞生長狀態良好，FITC標記的CD80直接免疫熒光檢測結果顯示，GPI-B7-1 CHO/DHFR-細胞表現出強黃綠色熒光。熒光強度為35.2。

2.2GPI-B7-1的鑒定結果通過Western blotting鑒定，在66 kD附近有一條淺褐色條帶，證明為GPI-B7-1，其量>10 μg/mL。

2.3GPI-B7-1-RCC細胞膜活化CTL對自身腫瘤細胞的殺傷作用經GPI-B7-1-CG-6327、CG-6327、GPI-B7-1-CHO/DHFR-細胞膜活化的CTL作用下，CG-6327細胞的A值分別為0.308、0.390、0.376，僅行體外培養的CTL作用下，CG-6327細胞A值為0.358。未加入CTL的CG-6327細胞A值0.516。不同細胞膜活化的CTL作用下，CG-6327細胞的A值比較，F=3.647，P<0.05。GPI-B7-1-CG-6327細胞膜活化的CTL殺傷CG-6327細胞活性與對照比較，P<0.05，其他細胞膜比較，P均>0.05。

3　討論

T淋巴細胞是機體介導腫瘤免疫應答的細胞,其活化需要雙信號，即由TCR介導的抗原特異性第一信號和由共刺激因子介導的非抗原特異性的第二信號。缺乏共刺激信號可以導致T細胞的免疫耐受或引起活化T細胞程序性死亡[6]。正常的免疫應答反應取決于B7-1-CD28介導的T細胞活化和B7-1-CTLA-4介導的抑制性信號之間的平衡[7]。B7-1是介導腫瘤免疫反應的一種重要的共刺激因子，因此，本實驗選用B7-1作為研究對象。

由于腫瘤細胞表面不能正常表達B7-1共刺激分子，導致經抗原識別初始活化的CTL細胞不能進入完全活化狀態，因而不能產生對腫瘤細胞有免疫攻擊作用的細胞因子；不能誘導產生對腫瘤細胞行膜裂解的信號，進行有效免疫攻擊[8]。GPI錨定蛋白轉化法為一種新型腫瘤細胞疫苗研制的方法。其優點在于：①許多原始細胞無論正常細胞或是腫瘤細胞均不易于在體外長期生長，且難以穩定轉染；而蛋白轉化法則不依賴于細胞增殖潛能及可轉染性，故可用于較難轉染的細胞，與細胞類型無關。②在同一細胞中復合基因的共轉染和協同表達在許多方面還困難重重，但蛋白轉化本質上可允許無限數量的蛋白同時傳遞或順序整和入同一細胞。③與基因轉化不同，蛋白轉化是一個非常迅速的過程，更具有可行性，尤其適用于臨床治療。④GPI蛋白轉化法不僅用于體外細胞修飾，還可以用于組織內原位細胞修飾[9]。人們已成功地將多種目標蛋白如PIM-1分子、CXCL10趨化因子、IL-2進行GPI轉化，證實了此法的可行性[10]。

RCC是一種免疫原性腫瘤，能通過多種機制逃避機體的免疫監視，這也是目前免疫治療效果不理想的主要原因[11]。國外研究發現，對RCC患者進行免疫治療中，大多數RCC患者都能從中獲益[12]。利用B7-1基因修飾的RCC細胞作為轉移性RCC的腫瘤疫苗已取得了一定的療效[13]。Anto等[14]將15例份腫瘤組織分別在組織培養基中進行培養，并導入B7-1基因，然后以接種疫苗的方式進行皮下注射，全身應用IL-2以增強由疫苗激活的T細胞增殖對轉移性RCC患者進行了一期臨床試驗，9例有反應，2例部分緩解，2例穩定，未見明顯過敏反應及不良反應。本研究結果顯示，GPI-B7-1-CG-6327細胞膜活化的CTL殺傷CG-6327細胞活性明顯強于未進行細胞膜錨定的細胞。提示通過GPI蛋白轉化法將B7-1共刺激信號錨定于RCC細胞膜上，確實可以彌補RCC細胞膜表面不表達B7-1的缺陷，從而提高了CTL對RCC的殺傷。我們使用腫瘤細胞膜進行錨定，一方面克服活瘤細胞可能的不良作用；另一方面細胞膜不再分裂，沒有代謝功能，這樣給GPI錨定分子一個穩定環境，使得整合到膜上的GPI蛋白較細胞上的蛋白具有更大的穩定性；且細胞膜在冷凍(-70 ℃)條件下可長期保存，又可從新鮮冰凍的瘤組織中提取細胞膜，使得從外科手術分離的腫瘤組織中分離細胞膜進行錨定成為可能[15]。

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Glycosyl-phosphatidylinositol-B7-1 anchoring into renal carcinoma cell membranes enhances CTL's ability of killing carcinoma cells

GEHuixin1,ZHANGYibing,LIHuizhong,CHANGJiwu

(1GuizhouCancerHospital,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guizhou550003,China)

ObjectiveTo investigate whether GPI-B7-1 anchoring into the renal carcinoma cell membrane can improve the cytotoxic T lymphocyte (CTL)'s ability of killing the cancer cells. MethodsWe selected the CHO/DHFR-cells that were genetically modified to highly express GPI-B7-1 in liquid nitrogen tanks, then, the target protein GPI-B7-1 was eluted from the CHO/DHFR-cells and purified. The activity was detected by Western blotting. The renal cell carcinoma cell line CG-6327 was established. We cultured the autologous CTL admixed with GPI-B7-1-CG-6327 membrane, CG-6327 membrane and GPI-B7-1-CHO/DHFR-membrane for 24 hours, and up to now, we got three kinds of CTL. Simple CTL cultured in vitro was taken as the control group, then these four kinds of CTL were added into 96-well plates which were inoculated with CG-6327 cells for the 24-hour killing experiment. The killing activity of CTL was detected by MTT.Results The killing activity (A value) of GPI-B7-1-CG-6327 cell membrane-activated CTL was statistically different as compared with that of the control group (P<0.05). No significant difference was found in the CTL cell killing activity activated by others as compared with that of the control group, allP>0.05.Conclusion GPI-B7-1 anchored protein can be transferred and anchored in the cell membrane of RCC surface which provides a second stimulus, and RCC cell membrane with double stimulation signal anchored by GPI-B7-1 has a greater effect for the activation of CTL.

kidney neoplasms; GPI-B7-1; cytotoxic T lymphocyte; tumor immunity

天津市科委重點科研資助項目(043114211)。

葛蕙心(1978-)，女，副主任醫師，碩士，主要從事泌尿系統腫瘤免疫治療方面的研究。E-mail:34865852@qq.com

簡介：暢繼武(1938-)，男，博士生導師，國務院特聘專家，國際泌尿外科學會會員，主要研究方向為腫瘤免疫及病理學。E-mail:changjiwu2004@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.29.003

R737.11

A

1002-266X(2016)29-0007-04

2016-01-08)