HPLC法測定不同產地馬先蒿屬植物中的毛蕊花苷

曹馨元， 曹文龍， 陶 銳， 欒 飛， 李茂星*

（1.蘭州大學藥學院，甘肅蘭州730000；2.蘭州軍區蘭州總醫院藥劑科，全軍高原環境損傷防治重點實驗室，甘肅蘭州730050；3.天祝縣藏醫藥開發研究所，甘肅武威733299）

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HPLC法測定不同產地馬先蒿屬植物中的毛蕊花苷

曹馨元1，2， 曹文龍3， 陶 銳1，2， 欒 飛2， 李茂星1，2*

（1.蘭州大學藥學院，甘肅蘭州730000；2.蘭州軍區蘭州總醫院藥劑科，全軍高原環境損傷防治重點實驗室，甘肅蘭州730050；3.天祝縣藏醫藥開發研究所，甘肅武威733299）

摘要：目的 建立HPLC法測定不同產地（甘肅、青海、四川）7種馬先蒿屬（Pedicularis L.）植物中毛蕊花苷的含有量。方法 馬先蒿屬植物75％甲醇提取液的分析采用Waters C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.27％冰醋酸水溶液（35∶65）；檢測波長330 nm；體積流量1 mL/min。結果 13個樣本中毛蕊花苷含有量的差異較大。其中，甘肅省武威市天堂鄉采集到的甘肅馬先蒿（莖、根）、中國馬先蒿、蘚生馬先蒿、俯垂馬先蒿中毛蕊花苷的含有量分別為3.62％、0.27％、6.49％、2.17％、3.47％，天祝縣采集到的中國馬先蒿、蘚生馬先蒿中分別為1.81％、2.26％；青海省采集到的甘肅馬先蒿、蘚生馬先蒿、白花甘肅馬先蒿中分別為3.28％、2.01％、2.45％；四川省諾爾蓋草原采集到的輪葉馬先蒿、碎米蕨葉馬先蒿、蘚生馬先蒿中分別為0.46％、1.22％、1.37％，RSD值均小于2％。結論 毛蕊花苷廣泛存在于馬先蒿屬植物中，其中甘肅馬先蒿地上部分中毛蕊花苷的含有量高于地下部分。

關鍵詞：馬先蒿屬；毛蕊花苷；產地；HPLC

馬先蒿是玄參科馬先蒿屬（Pedicularis L.）植物，關于其化學成分的研究表明［1-4］，該植物中含有環烯醚萜苷［5］、苯乙醇苷［6-8］、生物堿等多種化合物，具有滋陰補腎、補中益氣、健脾和胃、清熱解毒、利尿、保肝等作用。其中，毛蕊花苷（verbascoside）屬于苯乙醇苷類化合物，主要存在于木蘭科、菊科、薔薇科、唇形科、玄參科等多種植物中，因其抗炎、抗菌、抗腫瘤、保肝、抗氧化、抗衰老、免疫調節、抗病毒、增強記憶等多種藥理作用［9］，受到廣大學者的關注。作為馬先蒿屬植物的主要活性成分，建立其有效的定性定量分析方法是很有必要的。馬先蒿屬植物資源豐富，來源相對廉價，故合理的開發利用不僅有利于相關醫藥產品的研發，也會在一定程度上促進當地經濟的發展。有關毛蕊花苷含有量的測定方法已有較多文獻報道［10-13］，本實驗首次建立了HPLC法同時測定3種產地7種馬先蒿屬植物中該成分的含有量，該方法簡單、快速、經濟，能為其開發利用及品質評價提供參考，也可為其單體生物活性的進一步研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀，包括Waters 1525四元梯度泵、Waters-2998二極管陣列檢測器、Waters-2707自動進樣器、Waters-TCM柱溫箱（美國Waters公司）；HP-8453紫外可見分光光度計（美國惠普公司）；BP210s電子分析天平（德國Sartorius公司）；SK7200H超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 材料 甲醇為色譜純；水為注射用水；其他試劑均為分析純。毛蕊花苷對照品（實驗室自制，MS、NMR確定其結構，HPLC測定其純度＞97.5％）。7種馬先蒿藥材于2014年8月采自甘肅、青海及四川，分別為甘肅馬先蒿Pedicularis kansuensis、中國馬先蒿P.chinensis、蘚生馬先蒿P.Muscicola、碎米蕨葉馬先蒿P.cheilanthifolia、俯垂馬先蒿P.cernua、輪葉馬先蒿P.verticillata、白花甘肅馬先蒿P.kansuensis Maxim subsp.kansuensis f.albiflora Li。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters C18色譜柱（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.27％冰醋酸水溶液（35∶65），梯度洗脫；體積流量1 mL/min；柱溫25℃；進樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花苷對照品5.00 mg，置于10 mL量瓶中，10％甲醇溶解，定容至刻度，得標準品母液。再取母液適量，10％甲醇稀釋至質量濃度為52 μg/mL，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別取7種馬先蒿藥材適量，粉碎（過四號篩），精密稱取2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入75％甲醇50 mL，稱定質量，60℃回流提取30 min，冷卻，再稱定質量，75％甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液1 mL，稀釋到10 mL量瓶中，即得。測定前，以0.45 μm微孔濾膜濾過。

2.3 測定方法 精密量取供試品和對照品溶液10 μL，注入HPLC色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖1。

2.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液100、300、500、900、1 100、1 300 μL，分別定容至5 mL，進樣10 μL。以毛蕊花苷對照品溶液質量濃度（μg/mL）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得回歸方程Y=7 075.8X+ 1 396.9，r=0.999 8。結果表明，毛蕊花苷在1.3～169 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取毛蕊花苷對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下連續進樣6次。結果，RSD為0.68％，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩定性試驗 取同一供試品溶液，室溫下分別于0、2、4、6、12、24 h進行測定。結果顯示，各樣品峰面積的RSD分別為2.0％、0.89％、1.3％、0.72％、1.8％、2.1％、0.89％、1.9％、1.5％、0.93％、0.40％、0.27％、1.4％，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5.3 重復性試驗 取各藥材粉末適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定。結果，各樣品中毛蕊花苷的RSD分別為1.91％、3.35％、1.15％、1.85％、1.03％、1.76％、3.61％、2.22％、2.13％、1.17％、2.65％、1.72％、0.59％，表明該方法重復性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的甘肅馬先蒿6份，每份0.75 g，加入16.9 mg/mL對照品溶液500 μL，按“2.2.2”項下方法制備樣品溶液，在“2.1”項色譜條件下平行測定，記錄色譜圖，并計算加樣回收率，結果見表1。

1.毛蕊花苷1.verbascoside圖1　HPLC色譜圖　Fig.1 HPLC chromatogram s

2.5.5 含有量測定 精密稱取7種藥材粉末3份，每份2 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下分析，結果見表2。

表1　加樣回收試驗結果Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

表2　馬先蒿樣品中毛蕊花苷含有量（n=6）Tab.2 Content of verbascoside in Pedicularis L.samp les （n=6）

3 討論

3.1 流動相的選擇 毛蕊花苷是苯乙醇苷類化合物，具有多個酚羥基，在酸性條件下穩定性較好。本實驗考察了不同比例的乙腈-水、甲醇-水系統作為流動相的效果，最終確定色譜條件為甲醇-0.27％冰醋酸水溶液=35∶65。

3.2 檢測波長的選擇 毛蕊花苷化學結構復雜，具有多個共軛雙鍵，經紫外分光光度計全波長掃描，測得其最大吸收波長為330 nm，并以此作為檢測波長。

3.3 樣品制備 在供試品制備方法上，本實驗考察了75％甲醇及水對毛蕊花苷提取效率的影響，發現以前者為提取溶劑時效率最高。在此基礎上，又比較了熱回流和超聲對提取結果的影響，發現前者提取效率高。因此，確定以75％甲醇熱回流提取30 min為供試品制備方法，既簡便可靠，又不會造成有效成分的破壞。

3.4 資源利用 本實驗采用HPLC法測定了7種不同馬先蒿植物中毛蕊花苷的含有量，并以其為指標，考察了不同產地及品種馬先蒿的品質差異。結果顯示，7種馬先蒿植物莖葉中均含有毛蕊花苷，但含有量有差異，甘肅馬先蒿地上部分中毛蕊花苷的含有量高于地下部分，這為進一步保護資源、開發擴大用藥部位及資源的可持續利用提供了科學依據。而且，不同地區海拔、氣候等原因均可造成藥材中目標成分含有量的差異，本實驗比較了3個省份馬先蒿中毛蕊花苷的含有量，可為藥材品質評價及該成分生物活性的深入研究奠定基礎。

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Determ ination of verbascoside in plants of Pedicularis L.from different grow ing areas by HPLC

CAO Xin-yuan1，2， CAOWen-1ong3， TAO Rui1，2， LUAN Fei2， LIMao-xing1，2*
（1.School of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 73OOOO，China；2.Departmentof Pharmacy，Lanzhou General Hospital of PLA；Key Laboratory of Prevention and Cure for Plateau Environment Damageof PLA，Lanzhou 73OO5O，China；3.Tianzhu County DevelopmentResearch Institute for Tibetan Medicine，Wuwei733299，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an HPLCmethod for determining verbascoside in seven kinds of p1ants of Pedicularis L.from differentgrowing areas（Gansu，Qinghaiand Sichuan）.M ETHODS The ana1yses of p1ants of Pedicularis L.75％ methano1ic extractswere performed on Waters C18co1umn（4.6 mm×150 mm，5 μm），mobi1e phase was MeOH-0.27％ g1acia1acetic acid（35∶65），detection wave1ength was set at 330 nm，f1ow rate was 1 mL/min.RESULTS Therewere obvious differences in verbascoside content in thirteen samp1es.Among them，those in P.kansuensis（stems and roots），P.chinensis，P.muscicola and P.cernua in Tiantang（Wuwei，Gansu）were 3.62％，0.27％，6.49％，2.17％ and 3.47％，those in P.chinensis and P.muscicola in Tianzhu were 1.81％ and 2.26％，those in P.kansuensis，P.muscicola and P.kansuensis Maxim subsp.kansuensis f.albiflora Li（Qinghai）were 3.28％，2.01％ and 2.45％，and those in P.verticillata，P.cheilanthifolia and P.muscicola in Nouergai prairie（Sichuan）were 0.46％，1.22％ and 1.37％，respective1y.A11the RSDswere 1ess than 2％. CONCLUSION Verbascoside is wide1y distributed in p1ants of genus Pedicularis，whose content in the above-book=127,ebook=133ground part is higher than that in the under-ground part of P.Kansuensis.

KEY WORDS：Pedicularis L.；verbascoside；growing areas；HPLC

*通信作者：李茂星（1973—），男，博士，副主任藥師，從事中藥新藥研究與開發。Te1：（0931）8994676，E-mai1：1imaox2005@ a1iyun.com

作者簡介：曹馨元，碩士，從事天然藥物化學、中藥新藥研究與開發。Te1：（0931）8994676，E-mai1：caoxy14@1zu.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81374019）；甘肅省中醫藥管理局課題（GZK-2015-59）；全軍醫藥衛生科研項目（CLZ15JA05）

收稿日期：2015-03-20

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.028

中圖分類號：R284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0126-05