兩種方法測定茶葉中游離氨基酸含量的比較研究

陳　義，張秀清,李玉霞，郭紅萍

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院茶學(xué)系，信陽市茶產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)研究重點實驗室，河南 信陽 464000；

2. 光山縣凈居寺茶場，河南 信陽 464000；3. 光山縣凈居寺名勝管理區(qū)，河南 信陽 464000)

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農(nóng)業(yè)科學(xué)

兩種方法測定茶葉中游離氨基酸含量的比較研究

陳義1，張秀清2,李玉霞2，郭紅萍3

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院茶學(xué)系，信陽市茶產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)研究重點實驗室，河南 信陽 464000；

2. 光山縣凈居寺茶場，河南 信陽 464000；3. 光山縣凈居寺名勝管理區(qū)，河南 信陽 464000)

摘要：本研究從標準曲線相關(guān)系數(shù)、加標回收、精密度等方面對GB/T8314-2002和GB/T8314-2013進行比較。結(jié)果表明GB/T8314-2013比GB/T8314-2002相關(guān)系數(shù)要高、加標回收更準確，精密度兩者相當(dāng)，測得茶葉中氨基酸要低15%左右。

關(guān)鍵詞：茶葉游離氨基酸；分光光度法；茚三酮比色法；標準曲線

茶葉作為一種飲用產(chǎn)品，其滋味和香氣直接影響產(chǎn)品質(zhì)量及產(chǎn)品價格，茶葉中氨基酸是形成茶葉鮮爽滋味的重要物質(zhì)，同時也是參與香氣的形成重要物質(zhì)之一[1]，與茶葉品質(zhì)顯著正相關(guān)，所以其含量的測定準確與否顯得尤為重要。

茶葉中氨基酸總量的測定國標一直采用茚三酮比色法，方法的原理是：氨基酸在pH8.0的條件下與茚三酮反應(yīng)，形成紫色絡(luò)合物，利用分光光度計在波長570nm測定其吸光度，氨基酸濃度與吸光度成正比[2-3]。該標準最早由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所牽頭起草制定GB/T8314-1987，先后修訂2次，即GB/T8314-2002、GB/T8314-2013，筆者主要針對GB/T8314-2002和GB/T8314-2013的差異從標準曲線相關(guān)系數(shù)、加標回收、精密度等方面進行分析比較，結(jié)果表明GB/T8314-2013比GB/T8314-2002相關(guān)系數(shù)要高、加標回收更準確，精密度兩者相當(dāng)，測得茶葉中氨基酸要低15%左右。

1材料與方法

1.1實驗儀器

HH數(shù)顯恒溫水浴鍋，F(xiàn)A2104型分析天平(感量0.0001g)，微型植物試樣磨碎機，GF-2型鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱，SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，752紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)等。

1.2實驗茶樣與試劑

茶樣：信陽毛尖、信陽紅由信陽農(nóng)林學(xué)院茶葉研究所提供，鐵觀音從市場購買。

實驗試劑：磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，水合茚三酮，氯化亞錫，蒸餾水，谷氨酸。

1.3兩種標準曲線制作方法

國標GB/T8314-2002：分別吸取濃度為0.1mg/ml氨基酸標準液0.0ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml與一組25ml容量瓶中，各加水4ml、緩沖溶液0.5ml、和茚三酮溶液0.5ml，在沸水中加熱15min，冷卻后加水至25ml，放置10min后，用5mm比色杯，在570nm處，以試劑空白溶液作參比，測定吸光度(A)。

國標GB/T8314-2013：分別吸取1ml濃度梯度為0mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml氨基酸標準液與一組25ml容量瓶中，各加入茚三酮溶液0.5ml、和緩沖溶液0.5ml，在沸水中加熱15min，冷卻后加水至25ml，放置10min后，用5mm比色杯，在570nm處，以試劑空白溶液作參比，測定吸光度(A)。

1.4兩種標準方法回收率[4]

稱取信陽毛尖樣品3g用450ml沸蒸餾水沸水浴45min過濾，并用蒸餾水沖洗數(shù)次，冷卻后定容到500ml，吸取過濾液1.0ml于一組25ml容量瓶中，每個樣品中加入100ug/ml谷氨酸母液1ml，在依次加入茚三酮溶液0.5ml、和緩沖溶液0.5ml，在沸水中加熱15min，冷卻后加水至25ml，放置10min后，用5mm比色杯，在570nm處，以試劑空白溶液作參比，測定吸光度(A)，5次平行實驗，按兩種標準對實驗結(jié)果進行計算。

1.5兩種標準測定樣品氨基酸含量精密度實驗[5]

稱取茶葉樣品3g用450ml沸蒸餾水沸水浴45min過濾，并用蒸餾水沖洗數(shù)次，冷卻后定容到500ml，吸取過濾液1.0ml于一組25ml容量瓶中，依次加入茚三酮溶液0.5ml、和緩沖溶液0.5ml，在沸水中加熱15min，冷卻后加水至25ml，放置10min后，用5mm比色杯，在570nm處，以試劑空白溶液作參比，測定吸光度(A)，4次平行實驗，按兩種標準對實驗結(jié)果進行計算。

1.6結(jié)果計算

1.6.1樣品中氨基酸含量的計算

式中：C——根據(jù)樣品吸光度“E”值在標準曲線上所查得每毫升被測液中含氨基酸的毫克數(shù)除以1000，即得克量；V——樣品總體積的毫升數(shù)。V1——被測樣毫升數(shù)。

1.6.2 回收率的計算

式中：C1——根據(jù)加入標準母液樣品的吸光度“E”值在標準曲線上所查得的每毫升被測液中含氨基酸的毫克量；C——根據(jù)未加入標準母液樣品吸光度“E”值在標準曲線上所查得的每毫升被測液中含氨基酸的毫克量。

2結(jié)果與分析

2.1標準曲線制作結(jié)果

新舊標準主要區(qū)別由1.3可見主要體現(xiàn)在以下兩個方面：首先是標準液中氨基酸濃度與梯度都不一樣，舊標準分別是0mg、0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg，新標準分別是0mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg，由此可見新標準比舊標準氨基酸濃度梯度更大；其次，舊標準在標準曲線制作時，加入4ml的水，而新標準不加水，與樣品處理一致更合理。

表1　兩種標準曲線結(jié)果一覽表

按1.3 標準曲線制作方法進行標準曲線制作，實驗結(jié)果如表1，相關(guān)系數(shù)R2表示氨基酸的濃度與吸光度之間的線性關(guān)系，R2越接近1表明兩者相關(guān)性越高；通常R2大于0.90時，認為兩個變量有很強的線性相關(guān)性。從實驗結(jié)果得出R2均大于0.90，即兩種標準曲線制作方法氨基酸的濃度與吸光度兩個變量之間都有很強的線性相關(guān)性。且相關(guān)系數(shù)R2新標準>舊標準。但由標準曲線方程可見，對同一樣品，即同一吸光度，測得的氨基酸含量不同，而且相差較大，使氨基酸含量結(jié)果不可靠。

2.2兩種標準回收率實驗

表2　兩種標準曲線回收率計算

按1.4對兩種標準進行回收率實驗，實驗結(jié)果如表2，回收率指在樣品中加入已知濃度體積的標樣之后，測出的總含量減去原樣品中的含量除以已知標樣的含量就是回收率，回收率主要反應(yīng)該方法的準確性，回收率越接近1，實驗越準確，該實驗中不同標準曲線計算得到的回收率不同[4]，GB/T8314-2002計算氨基酸加標回收率是1.17，與實際相差甚遠，說明按GB/T8314-2002所測得氨基酸比實際高，相比之下GB/T8314-2013氨基酸加標回收率是1.004，GB/T8314-2002所測得氨基酸與實際氨基酸含量相當(dāng)，新標準比舊標準更合理。

2.3兩種標準測定樣品精密度

表3　精密度分析結(jié)果

按1.5 方法精密度實驗，實驗結(jié)果如表3，精密度是指多次重復(fù)測定同一樣品時各測定值之間彼此相符合的程度，表征測定過程中隨機誤差的大小。同時表示測量的再現(xiàn)性，是保證準確度的先決條件，但是高的精密度不一定能保證高的準確度。好的精密度是保證獲得良好準確度的先決條件，一般說來，測量精密度不好，就不可能有良好的準確度。反之，測量精密度好，準確度不一定好，這種情況表明測定中隨機誤差小，一般相對標準偏差(%)在0～5之間，表示該處理樣品的方法隨機誤差小，可以給保證獲得良好準確度的結(jié)果提供了先決條件[6]，由實驗結(jié)果可見，兩種標準測定樣品氨基酸平行實驗RSD(%)均較低，即精密度均較高，由此可見，兩種標準測定樣品氨基酸含量精密度均較高。

3結(jié)論

茶葉中氨基酸含量的測定主要有自動分析儀法、高效液相色譜法、毛細管電泳法以及茚三酮比色法等方法，其中前三種方法重現(xiàn)性好，儀器穩(wěn)定，結(jié)果可靠，但前處理復(fù)雜，成本高，所以目前茶葉中氨基酸測定國標法仍然采用茚三酮比色法。劉曉霞、周國蘭[7]等人對GB/T8314-2002測定方法進行了探討，黃本芬、呂小艇[8]等人對GB/T8314-2002中存在的問題提出了自己的觀點，筆者主要針對新舊標準的差異即新標準中在標準曲線的制作是與樣品處理一致，反應(yīng)體系一開始沒有加4ml水，而舊標準在標準曲線制作時反應(yīng)體系加入4ml水，從標準曲線相關(guān)系數(shù)、加標回收、精密度等方面進行分析比較，結(jié)果表明GB/T8314-2013比GB/T8314-2002相關(guān)系數(shù)要高、加標回收更準確，精密度兩者相當(dāng)，測得茶葉中氨基酸要低15%左右。

參考文獻：

[1]宛曉春,黃繼軫,龔正禮.茶葉生物化學(xué)[M].3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2003.

[2]全國標準化技術(shù)委員會. GB 8314-2002茶 游離氨基酸總量測定[S].北京：中國標準出版社，2002．

[3]全國標準化技術(shù)委員會. GB 8314-2013茶 游離氨基酸總量測定[S].北京：中國標準出版社，2013．

[4]吳樹宏,周春華.加標回收率的計算方法的探討[J].甘肅環(huán)境研究與監(jiān)測.2000,13(3):179-183.

[5]蓋鈞益.試驗統(tǒng)計方法[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1985：44-46.

[6]南京大學(xué)編寫組.無機及分析化學(xué) [M].3版.北京：高等教育出版社，1996:262-265．

[7]劉曉霞，周國蘭，何萍，等. 茶葉中游離氨基酸及其總量的國標法測定探討[J].貴州茶葉，2008,1(133):13-17.

[8]黃本芬，呂小艇，何正秀. 改進茶葉中游離氨基酸總量測定方法[J].食品與發(fā)酵科技，2012,2(48):94-96.

(編輯：嚴佩峰)

Comparative Study of Determination of Amino Acid Content in Tea by Two Different Methods

CHEN Yi1, ZHANG Xiu-qing2，LI Yu-xia2, GUO Hong-ping3

(1.Tea Department of Xinyang College of Agriculture and Forestry, Key Laboratory of Basic Research in Xinyang Tea Industry,Xinyang 464000, China； 2. Tea Plantation of Jingju Temple in Guangshan County, Xinyang 464000, China；3. Scenic Spots Management Area of Jingju Temple in Guangshan County, Xinyang 464000, China)

Abstract：In this study, the GB/T8314-2002 and GB/T8314-2013 were compared in terms of standard curve correlation coefficient, adding standard recovery and precision of method. The results showed that the correlation coefficient of GB/T8314-2013 was higher than that of GB/T8314-2002, at the same time the recovery and the precision of the former was more accurate, and the amino acid content in the same sample was lower 15% .

Keywords：dissociated amino acids in tea;Spectrophotometry;Ninhydrin colorimetry;standard curve

中圖分類號：TS272.7

文獻標識碼：A

文章編號：2095-8978(2016)01-0093-03

作者簡介：陳義(1980—)，男，安徽舒城人，講師，碩士，主要研究茶葉化學(xué)與茶葉加工.

基金項目：2015年度河南省高等學(xué)校重點科研項目(15B210009).

收稿日期：2015-09-20