一株芽孢桿菌溶磷動力學研究

劉　冬，陶　濤，李　萍，高智謀，畢璋友，姜曉斌，葉　明

(1.安慶職業技術學院 園林園藝系，安徽 安慶 246003；2.安徽農業大學 生命科學院，安徽 合肥230036；

3.合肥工業大學 生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

?

一株芽孢桿菌溶磷動力學研究

劉冬1,2，陶濤3，李萍1，高智謀2，畢璋友1，姜曉斌1，葉明3

(1.安慶職業技術學院 園林園藝系，安徽 安慶 246003；2.安徽農業大學 生命科學院，安徽 合肥230036；

3.合肥工業大學 生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

摘要：將1株具有溶磷能力的芽孢桿菌P8接種于以磷酸鈣為唯一磷源的液體培養基中，對其降解磷酸鈣效果及動力學進行研究。結果表明，該菌株具有穩定的溶磷活力，芽孢桿菌P8降解磷酸鈣動力學方程遵循零級反應。提高培養基中葡萄糖或磷酸鈣的初始濃度，均能提高芽孢桿菌P8降解磷酸鈣的速率。

關鍵詞：芽孢桿菌；溶磷；動力學

磷是植物生長所必需的礦質元素，磷營養不足會導致作物減少產量[1]。目前，在生產中多施用高水溶性磷肥，然而磷肥施入土壤后易形成難溶性的磷酸鹽并迅速被土壤礦物吸附固定，而且大量長期使用化肥，還會造成諸如土壤板塊等環境問題[2]。因此，在這種情況下迫切需要尋找一種更環保、更有效的方法解決由磷酸鹽導致的土壤板塊問題。

解磷微生物能將土壤中難溶性磷轉化可溶性磷。土壤中難溶性磷可分為兩類，一類是磷酸鹽或結構復雜的磷灰石等無機磷酸鹽，另一類是核酸、磷脂和植素等含磷有機物。對于前者，解磷微生物主要通過代謝活動產生有機酸促使磷酸鹽溶解[3]。對于后者，解磷微生物主要通過分泌植酸酶、核酸酶和磷酸酶將其分解[4]。芽孢桿菌屬中某些細菌具有較強的解磷能力[5]，本研究以一株具有較強解磷能力的芽孢桿菌P8為研究對象，對其降解磷酸鈣動態過程進行研究。

1材料與儀器

1.1材料

供試菌株為芽孢桿菌P8(Bacillus.sp P8)，由合肥工業大學微生物資源與應用實驗室篩選和保藏。培養基a：Ca3(PO4)2 4 g，葡萄糖 10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KCl 0.2 g，MnSO41 mL(0.004 g·L-1)，FeSO4(Fe·EDTA)0.1 mL(0.002 g·L-1)，蒸餾水1000 mL，pH 7.0±0.2。培養基b：磷酸鈣濃度為10 g·L-1，其他條件同培養基a。培養基c：葡萄糖濃度為15 g·L-1，其他條件同培養基a。試驗中如無特殊說明，均使用培養基a進行相關研究。

1.2主要試驗儀器

KQ118超聲波細胞破碎儀；SW-CJ-1F雙面無菌操作臺；TGL-16C飛鴿離心機；DZF-6021真空干燥箱；分析天平；SHY-2A水浴恒溫振蕩器等。

2方法

2.1 搖瓶培養

在盛有30 mL培養基的100 mL三角瓶中，接種1 mL菌體懸浮液(將在牛肉膏蛋白胨上培養24 h的細菌刮入無菌水中，制備成菌體懸浮液，菌數約為106cfu·mL-1)，同時做空白對照(在未接種培養基中加入1mL無菌水)，在30℃，140r·min-1條件下培養，并每隔24 h取出2瓶測定(含對照)，共測定9次。

2.2磷酸鈣濃度及降解率測定

將培養液(培養基初始磷酸鈣濃度記為c)搖勻，吸取1 mL渾濁液于1.5 mL離心管(已稱重，記為m1)，在10000 r·min-1條件下，離心15 min，并將沉淀離心洗滌(加1 mL蒸餾水)2次，放入30℃真空干燥箱，真空干燥24 h，稱重(記為m2)，則磷酸鈣降解率η為：

2.3葡萄糖、可溶性磷和生物量的測定

以DNS法[6]測定葡萄糖量，采用稀釋平板涂布法[7]測定生物量；磷含量用鉬銻抗比色法[8]測定，以上試驗均做3次重復。試驗數據采用Orgin 7.5和SAS 9.1進行統計分析。

3結果與分析

3.1降解率與溶磷量的關系

由圖1可知，對溶磷量與降解率進行線性擬合，得R=0.8633，p=0.0027<0.01，故溶磷量與降解率相關性顯著。而發酵液中的溶磷量雖與降解率均呈上升趨勢，但24 h、48 h時其溶磷量分別為-11.61 mg·L-1、-6.23 mg·L-1，這可能是因為細菌在生長繁殖時，不僅分解難溶性的磷化合物，而且還同化一部分分解出來的磷，當后者作用大于前者時，使得有效磷含量低于對照值，反之則高于對照值，故菌株溶磷活力是穩定的。

圖1　降解率與溶磷量的相關性分析

3.2降解率與生物量、葡萄糖的關系

由圖2可知，在菌體快速增殖期(發酵前4 d)，葡萄糖濃度迅速降低，磷酸鈣降解率迅速提高，在此階段，磷酸鈣降解率達到38.12%。

圖2　降解率與生物量、葡萄糖的關系

4 d后，由于葡萄糖等營養物質的減少，菌體生長進入衰退期，菌體數目逐漸減少，但降解率依然呈上升趨勢，這可能是因為菌體在快速增殖期，分泌出的大量有機酸[3,5]與鈣等離子結合，使磷酸鹽中的磷酸根釋放出來，快速降解磷酸鈣；而在衰退期，隨著菌體數目的減少，有機酸類物質亦減少，降解磷酸鈣速度降低。

以降解率為橫坐標，生物量、葡萄糖濃度分別為縱坐標，進行擬合發現，葡萄糖濃度與降解率關系顯著，其相關系數R值為-0.9161，P<0.01，而生物量與降解率的相關系數R為-0.1950，p=0.6151>0.05，生物量與降解率關系不顯著。故以下試驗考察不同初始葡萄糖、磷酸鈣濃度條件下該菌株對磷酸鈣的降解作用。

3.3磷酸鈣降解動力學

對于一般生化反應速率可用式(1)表示[9]。

(1)

式(1)中，V為反應速率，Vm為最大反應速率，C為底物濃度，K為半飽和速率常數。當C<

(2)

V=Vm(3)圖4芽孢桿菌P8降解磷酸鈣動力學曲線

降解過程為零級反應，速率常數為k0=Vm根據式(2)和(3)分別求得底物與時間的關系式，lnC=a+k1t (一級反應) ；C=b+k0t(零級反應) 。

表1　芽孢桿菌P8降解磷酸鈣動力學方程

由圖4及表1可知，將芽孢桿菌在培養基a、b、c中培養，其對磷酸鈣的降解均能較好地用零級反應形式表示，即磷酸鈣以恒定的反應速率降解，式(3)表示的動力學表達式應與初始濃度無關。而試驗中，其降解速率常數卻受初始磷酸鈣濃度、葡萄糖濃度的影響。當磷酸鈣初始濃度由4 g·L-1升高到10 g·L-1時(初始葡萄糖濃度不變)，磷酸鈣的降解速率約提高一倍，可能是由于磷酸鈣釋放的有效磷量隨其濃度提高而增加，這在一定程度上減弱了磷對細菌生長的限制，使細菌快速生長并在代謝過程中迅速將難溶性磷轉化為有效磷，同時葡萄糖為芽孢桿菌P8生長所必需的碳源和能量，故當葡萄糖初始濃度由10 g·L-1升高到15 g·L-1時(初始磷酸鈣濃度不變)，磷酸鈣的降解速率亦有提高。

將D值定義為芽孢桿菌P8降解磷酸鈣的降解率為90%時所需時間[10]，芽孢桿菌P8降解磷酸鈣的效果采用類比分析方法并以D值大小來比較。

表2　芽孢桿菌P8降解磷酸鈣D值

注：X和Sx分別表示為平均值和標準偏差，a表示在p<0.01時各處理間差異顯著。

由表2可知，在相同培養條件下，提高葡萄糖或磷酸鈣的初始濃度(限于試驗濃度范圍)，均能提高芽孢桿菌P8降解磷酸鈣的效率。

4結論

芽孢桿菌P8具有穩定的溶磷活力，其降解率與生物量之間無顯著關系。在培養基a、b、c中，芽孢桿菌P8降解磷酸鈣動力學方程遵循零級反應。在相同培養條件下，提高葡萄糖或磷酸鈣的初始濃度(限于試驗濃度范圍)，均能提高芽孢桿菌P8降解磷酸鈣的速率。

參考文獻：

[1]Hameeda B, Harini G O P Rupelab S P, et al. Growth promotion of maize by phosphate-solubilizing bacteria isolated from composts and macrofauna[J]. Microbiology Research, 2008(163):234-242.

[2]Vassilev N, Vassileva M. Biotechnological solubilization of rock phosphate on media containing agroindustrial wastes[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2003(61):435-440.

[3]Feng K, Lu H M, Sheng H J, et al. Effect of organic ligands on biological availability of inorganic phosphorus in soils[J]. Pedosphere, 2004, 14(1):85-92.

[4]Trolldenier W D. Uptake of P from apatite by Pinus sylvestris seedlings colonized by different ectomycorrhizal fungi[J]. Plant Soil, 2000(218):249-256.

[5]Fernández L A, Zalba P, Gómez M A, et al. Phosphate-solubilization activity of bacterial strains in soil and their effect on soybean growth under greenhouse conditions[J]. Biology and Fertility of Soils, 2007(43):805-809.

[6]張成明, 姜立, 李十中. 酸水解對DNS法測定甜高粱中總糖的影響[J].農業機械學報, 2014 (9):200-204 .

[7]薛邦玉，許坤，趙云煥. 直接藥敏試驗在肉雞生產中的臨床應用意義[J].信陽農林學院學報, 2014(4): 92-100.

[8]柯春亮，陳宇豐，周登博, 等. 香蕉根際土壤解磷細菌的篩選、鑒定及解磷能力[J].微生物學通報, 2015(6): 1032-1042.

[9]張秀霞, 吳偉林, 單寶來，等. 固定化降解菌Q5降解喹啉動力學[J].石油學報, 2009, 25(6)：442-446.

[10]Osman E. Hypochlorite inactivation kinetics of Listeria monocytogenes in phosphate buffer[J]. Microbiology Research, 2004(159)：167-171.

(編輯：嚴佩峰)

The Study on Phosphate Solubilizing Kinetics of a Bacillus

LIU Dong1,2, TAO Tao3, LI Ping1, GAO Zhi-mou2,BI Zhang-you1, JIANG Xiao-bin1, YE Ming3

(1.Department of Landscape and Horticulture, Anqing Vocational&Technical College, Anqing 246003, China;2.School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；3.College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract：One strain of Bacillus sp.P8 with phosphate-solubilizing ability was inoculated in the liquid mediums using calcium phosphate as the sole phosphate source. The effect and kinetics of calcium phosphate degradation (CPD) by Bacillus sp.P8 was studied. Results showed that the phosphate-dissolving activity of Bacillus sp. P8 was stable. The CPD followed the zero-order model. When the initial calcium phosphate or glucose concentration increased, the CPD rate increased.

Keywords：Bacillus sp；phosphate-solubilizing；kinetics

中圖分類號：S154.3

文獻標識碼：A

文章編號：2095-8978(2016)01-0096-04

作者簡介：劉冬(1982—)，男，安徽淮北人，講師，在讀博士，研究方向：農業微生物.

基金項目：安徽省高等學校省級自然科學研究重點項目(KJ2014A148，KJ2015A368)；安徽省重大教學改革研究項目(2015zdjy181)；安徽省教壇新秀(2015jtxx157)

收稿日期：2015-11-28