人膽囊癌裸鼠移植瘤模型的建立及超聲觀察

陳娟++++++張炎晶++++++苗燕++++++趙育芳++++++劉利平

[摘要] 目的 建立人膽囊癌裸鼠皮下移植瘤模型，并對其進行超聲觀察。 方法 培養GBC-SD細胞，將細胞濃度調至1×107/ml，取0.2 ml注射于裸鼠皮下。成瘤后作為瘤源，瘤塊剪成約2 mm3的組織塊，置入裸鼠皮下，待其成瘤。以后各代模型的瘤源均來自上一代模型，用同樣的方法接種。記錄瘤塊成瘤率、成瘤時間、生長特點。觀察瘤塊外觀，并進行超聲、解剖及病理觀察。 結果 細胞注射法及組織塊法可成功建立膽囊癌裸鼠移植瘤模型，成瘤率為100%；各代組織塊法之間成瘤時間差異無統計學意義（P>0.05）；二維超聲測量瘤體最大徑與大體游標卡尺測量差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 將細胞注射法與組織塊法結合，是一種理想的建立人膽囊癌裸鼠移植瘤模型的實驗方法。

[關鍵詞] 膽囊癌；裸鼠；移植瘤；動物模型

[中圖分類號] R735.8 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）02（b）-0004-04

Establishment of human gallbladder cancer nude-mouse transplanted tumor model and its ultrasonic observation

CHEN Juan ZHANG Yan-jing MIAO Yan ZHAO Yu-fang LIU Li-ping▲

Department of Ultrasound，the First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030000，China

[Abstract] Objective To establish the human gallbladder cancer nude-mouse transplanted tumor model and to observe by ultrasound. Methods GBC-SD cells were cultured and the cell concentration was adjusted to 1×107/ml，of which 0.2 ml was subcutaneously injected to nude mouse.The cultivated tumor was selected as the tumor source and cut into tissue blocks of 2 mm3，which were then implanted into the subcutaneous tissue of nude mouse to cultivate tumor.The tumors of later generation were all cultivated from sources of tumors of the former generation by the same method.The tumor formation rate，time of tumor formation，and features of tumor formation were recorded.The appearance of tumor block was observed and ultrasonic，anatomical and pathological observations were conducted. Results The method of cell injection and tissue block implantation could successfully establish the gallbladder cancer nude-mouse transplanted tumor model，with tumor formation rate of 100%.The tumor formation time of each generation showed no statistically significant difference （P>0.05）.The maximum diameter of tumor detected by ultrasound and vernier caliper showed statistically significant differences （P<0.05）. Conclusion Combination of cell injection and tissue block implantation is a favorable method to establish the gallbladder cancer nude-mouse transplanted tumor model.

[Key words] Gallbladder cancer；Nude mouse；Transplanted tumor；Animal model

膽囊癌是膽道系統惡性腫瘤中最常見的一種類型，占消化道惡性腫瘤的第5位[1]。近年來，膽囊癌的發病率有逐漸增高的趨勢，且早期原發性膽囊癌無特異性的臨床表現，臨床發現的膽囊癌多為中晚期，根治性切除率低，治療效果及預后差[2-4]。因此建立合適的動物模型是研究膽囊癌體內生長、轉移機制的重要工具，對膽囊癌的早期診斷、治療及有效評估治療效果、預后等有深遠意義。本研究將GBC-SD細胞注射法和瘤組織塊法結合，成功建立了裸鼠移植瘤模型，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

GBC-SD人膽囊癌細胞購自中國科學院細胞庫，細胞株從一位61歲的男性低分化膽囊癌患者中建立。細胞培養于含10%胎牛血清（杭州四季青公司），0.4%雙抗的RPMI1640（Gibco公司）培養基中，置于培養箱中連續培養及傳代，培養箱溫度保持在37℃，培養環境為5.0%CO2，1～2 d換液1次，細胞處于對數生長期時用胰酶消化后收集，加入適量生理鹽水調整細胞懸液濃度至1×107/ml，置于1 ml的EP管中備用。

1.2 實驗動物

BALB/c裸鼠33只，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，鼠齡3～4周，雄性，體重16～18 g，飼養于山西醫科大學實驗動物中心，實驗條件符合SPF要求，所用物品均經高壓滅菌消毒。裸鼠置于恒溫、恒濕、無菌、凈化的屏障系統內飼養。

1.3 細胞注射行裸鼠皮下移植瘤模型的制備

隨機取其中2只裸鼠，10 ml/kg 5%水合氯醛腹腔注射麻醉，碘伏消毒右前肢皮膚，用1 ml注射器吸取0.2 ml細胞懸液注射于右前肢皮下。觀察裸鼠移植部位，了解腫瘤生長情況及生長速度。

1.4 組織塊法行裸鼠皮下移植瘤模型的制備

細胞注射接種，皮下瘤塊達成瘤標準（瘤塊直徑約1.0 cm）后，作為瘤源，無菌條件下取出瘤塊，去除脂肪、壞死組織及纖維組織，取邊緣活力旺盛的組織用無菌生理鹽水漂洗，眼科剪剪成約2 mm3的組織塊放入盛有生理鹽水的培養皿中備用。另取裸鼠7只，消毒雙前肢下皮膚，用眼科剪剪開2～4 mm長的小口，將備好的小瘤塊2～3塊置入皮下，縫合皮膚，消毒切口周圍，青霉素肌內注射3 d，種瘤3 d后拆線。觀察裸鼠移植部位，了解腫瘤生長情況及生長速度。

待前一代裸鼠移植瘤達成瘤標準后，任選一只作為瘤源，用同樣的組織塊法進行下一輪接種傳代，制備皮下移植瘤模型，第二代種瘤9只，18個瘤塊，第三代種瘤15只，30個瘤塊。以后各代模型的瘤源均來自上一代模型。

1.5 瘤塊的超聲檢查

外觀游標卡尺所測最大徑達1 cm后，超聲觀察其特點。用GE Logic E9超聲診斷儀，ML6～15線陣寬頻探頭觀察，實驗中顯像深度基本保持一致，圖像增益、聲壓、機械指數均保持不變。

1.6觀察項目

1.6.1 裸鼠移植瘤生長情況及生長速度 觀察裸鼠的健康狀態、一般情況及皮下腫瘤形成情況，種瘤后每2天用數字游標卡尺測量皮下瘤的最大徑。記錄不同成瘤方法的成瘤時間及成瘤率。

1.6.2 瘤塊超聲 常規超聲掃查瘤塊，觀察記錄瘤塊大小、回聲及血流特征。

1.6.3 瘤塊的病理學檢查 實驗完成后處死裸鼠，完整切取腫瘤組織，標本常規10%甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色，光鏡下觀察。

1.7 統計學分析

采用統計軟件SPSS 16.0對實驗數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組獨立樣本的比較采用方差分析，單樣本均數的比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成瘤率的統計情況

人膽囊癌細胞GBC-SD接種裸鼠2只，均成瘤，成瘤率100%。第一代組織塊法接種裸鼠7只，每只2個，7只裸鼠14個均成瘤，成瘤率為100%。第二代組織塊法接種裸鼠9只（18個），其中一只裸鼠因實驗疏忽漏喂水而死亡，剔除實驗，其余8只（16個）裸鼠均成瘤，成瘤率為100%。第三代組織塊法接種裸鼠15只（30個），均成瘤，成瘤率為100%。

2.2 瘤體生長特點及成瘤時間

細胞注射組及瘤組織塊組種瘤6 d后，接種部位陸續開始出現瘤塊。后瘤塊緩慢增大，瘤塊最大徑達4 mm后，生長速度逐漸加速。

細胞注射組皮下瘤塊最大徑達1 cm的時間為（16.5±0.7）d。第一代組織塊法組、第二代組織塊法組、第三代組織塊法組皮下瘤塊最大徑達1 cm的時間分別為（17.1±2.1）、（17.5±1.9）、（17.6±1.6）d。組織塊法各代之間瘤塊最大徑達1 cm的時間，差異無統計學意義（P>0.05）。

2.3瘤體觀察

2.3.1 外觀觀察 瘤體質硬，固定于肢體皮下，膨脹性生長，呈類球形，與周圍組織分界清楚，易剝離，晚期部分瘤體處皮膚可見破潰。

2.3.2 超聲觀察 瘤體呈低回聲，內部回聲均勻或不均勻，與周圍皮膚分界清楚，隨著瘤塊增大，中央可呈無回聲。彩色多普勒血流顯像可見部分瘤塊內有點狀、線狀或分支狀彩色血流信號（圖1）。二維超聲所測瘤塊最大徑為（0.88±0.09）cm，小于外觀游標卡尺所測值1 cm，差異有統計學意義（P<0.05）。

圖1 組織塊法瘤塊超聲觀察

2.3.3 解剖觀察 瘤體蒼白，質硬，切開后，中間紅色質軟，有壞死組織，周圍是活躍的腫瘤細胞層，腫瘤的外層包裹有包膜（圖2）。

圖2 組織塊法瘤塊解剖觀察

2.4 病理切片觀察

瘤塊病理切片HE染色細胞形態符合人膽囊癌的特征。瘤體組織內細胞排列紊亂，內有大量分化程度低，形狀不規則、大小不一，胞質豐富的深染巨核細胞，細胞核異形性明顯，同時可見少量核分裂象及多核瘤巨細胞（圖3）。

圖3 瘤塊病理切片（HE，×400）

3 討論

原發性膽囊癌是膽道系統最常見的惡性病變，占消化道惡性腫瘤的第5位[1]，膽囊癌惡性程度高，侵襲能力強，手術切除率低，輔助治療效果不佳，預后較差[2]，因此值得深入研究。動物腫瘤模型為膽囊癌的研究提供了重要平臺。

1969年Rygaard等[5]首次將人結腸癌組織接種于裸鼠皮下，成功建立了裸鼠皮下移植瘤模型后，裸鼠便被廣泛地應用于人類腫瘤的基礎理論和臨床治療的實驗性研究中。由于裸鼠移植瘤在組織病理形態學、生物學特性及對化療藥物的敏感性等方面與其原發的腫瘤相似，因此，裸鼠移植瘤模型是目前腫瘤學研究中較為理想的動物模型[6]。

目前常用的皮下移植瘤建模方法是細胞注射法和瘤組織塊法[7]。本研究將兩種方法結合，大大簡化了移植瘤模型的制備過程，適合長期傳代。

本研究首先將體外培養的GBC-SD細胞懸液注射到裸鼠皮下，制備皮下移植瘤模型。同許多學者研究[8-10]結果一致：注射法皮下移植瘤模型成瘤率高，細胞致瘤性強，注射較小的瘤細胞量即可致瘤，腫瘤生長平穩，生存期穩定。但細胞注射法成瘤時間相對較長，細胞體外培養時復蘇、傳代、凍存過程中都極易污染，培養周期長，比較昂貴，不適合長期傳代[11]。

傳統的組織塊法瘤源多取自手術切除的存活膽囊癌組織，但實驗成本較高，實驗條件要求較高，取材難度較大。本研究細胞注射法成瘤后作為瘤源進行裸鼠異體移植和傳代，避免了以上的不足，簡化了移植瘤模型的制備。另外瘤塊鼠間異體移植時成瘤穩定，成瘤率達100%。徐鴻緒[12]的研究用細胞注射法結合瘤組織塊法成功建立了前列腺癌裸鼠移植瘤模型，裸鼠移植瘤成功率可達100%。洪國斌等[13]用此法成功制備了肝癌裸鼠移植瘤模型，腫瘤造模成功率為93.75%。湯靜[14]用此法成功制備了肝癌裸鼠移植瘤模型，腫瘤造模成功率為100%。提高瘤組織塊法成瘤率的方法有：瘤源的取材盡快完成；欲接種的腫瘤組織制備成適宜大小的瘤組織塊；在裸鼠飼養及各種操作過程中嚴格遵循無菌原則等。

目前對于移植瘤建模方式的研究主要集中在探討建模成瘤率及移植瘤與原腫瘤一致性的問題[15]。本研究兩種方法成瘤率皆高，幾乎可達100%，病理切片HE染色結果顯示兩種方法在組織學形態上并無差異，可以推論在相同的微環境下通過細胞懸液所建立的模型和通過組織塊建立的模型組織學形態及生物學特性同樣無差異。

總之，將細胞注射法與組織塊法結合，移植瘤能在裸鼠體內持續增殖和長期傳代，且移植瘤的形態與原人體腫瘤保持一致，是一種理想的建立人膽囊癌裸鼠移植瘤模型的實驗方法，可為后續膽囊癌的研究提供良好的實驗平臺。

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（收稿日期：2015-12-02 本文編輯：衛 軻）