體外心臟震波對大鼠心肌梗死后心肌凋亡的影響

楊文慧　郭　濤楊　莉　華寶桐楊　萍王　鈺(昆明醫科大學附屬延安醫院老年病科，云南　昆明　65005)

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體外心臟震波對大鼠心肌梗死后心肌凋亡的影響

楊文慧郭濤1楊莉華寶桐1楊萍1王鈺1
(昆明醫科大學附屬延安醫院老年病科，云南昆明650051)

〔摘要〕目的研究體外心臟震波治療( CSWT)對大鼠心肌梗死后( MI)心肌細胞凋亡及凋亡蛋白的影響。方法結扎大鼠左冠狀動脈前降支建立大鼠急性心肌梗死模型，隨機分為假手術( Sham)組( n = 10)、MI組( n = 10)及CSWT組( n = 10)。CSWT治療4 w后，取各組心肌樣本進行TUNEL檢測觀察心肌細胞凋亡，Masson染色觀察心肌纖維化，Western印跡檢測Bax、Bcl－2和Caspase－3蛋白表達。結果與Sham組相比，MI和CSWT組心肌細胞凋亡指數及纖維化程度均增高，Bax和Caspase－3表達顯著上調，Bcl－2表達明顯下調( P＜0．05) ;而CSWT組較MI組，心肌細胞凋亡指數及纖維化程度均降低，Bax和Caspase－3表達下調，Bcl－2則表達上調( P＜0．05)。結論大鼠心肌梗死后心肌凋亡明顯增加，體外心臟震波可抑制大鼠心肌梗死后細胞凋亡，減輕左心室纖維化。

〔關鍵詞〕體外心臟震波;心肌梗死;凋亡

1昆明醫科大學第一附屬醫院心內科

第一作者:楊文慧( 1982－)，女，在讀博士，主治醫師，主要從事冠心病、心律失常的基礎及臨床研究。

體外心臟震波治療( CSWT)是一項新興的缺血性心臟病治療方法。CSWT通過體外導入低能量機械脈沖，在心肌組織中產生剪切力和空穴效應，促進多種生長因子表達，誘導缺血心肌局部血管新生，從而改善心肌灌注和微循環，減輕缺血性心臟病患者癥狀并改善其心功能〔1〕。心肌細胞凋亡是引起心肌梗死后心功能不全、心室重塑及心律失常的重要原因。減輕和抑制心肌細胞凋亡的發生，可以改善心肌梗死患者的預后。本課題擬探究CSWT對大鼠心肌梗死后心肌細胞凋亡的影響以及相關凋亡蛋白的變化情況。

1材料與方法

1. 1主要儀器和試劑體外心臟震波治療儀(瑞士STORZ MEDICAL公司，MODULITH SLC)，熒光顯微鏡(日本Olympus BX53)，小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司，ALCV9)，臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf 5804R)，凝膠成像系統(美國GE ImageQuant LAS 4000)。DeadEnd TUNEL比色法檢測系統(美國Promega)，Masson三色染色液(珠海貝索) ; BCA蛋白定量分析試劑盒(美國Thermo)。Bax、Bcl－2、Caspase－3抗體(德國Millipore)，GAPDH抗體(美國Santa)，辣根過氧化物酶標記的二抗(美國Thermo)，異氟烷(上海雅培)等。

1. 2實驗分組及動物模型構建選取健康雄性SD大鼠30只，體重( 230±35) g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司〔SCXK(湘) 2013－0004〕。隨機分為假手術組( Sham)、心肌梗死組( MI)和心臟震波治療組( CSWT)，每組10只。MI和CSWT組建立心肌梗死模型:于左心耳下方1～2 mm處與肺動脈圓錐間結扎大鼠左前降支冠狀動脈〔2〕。見心尖處心肌變蒼白、搏動減弱為結扎成功。Sham組不行冠脈結扎，其余操作步驟同其他兩組。術后，Sham組和MI組僅給予常規飼喂，無其他特殊處理; CSWT組進行體外心臟震波治療4 w。

1. 3大鼠CSWT CSWT組在建模后第2天開始CSWT，每周1、3、5進行，治療4 w，共12次。異氟烷吸入麻醉大鼠，仰臥位固定。心臟震波儀探頭水囊緊貼大鼠左胸壁心臟搏動處后開始脈沖發放。每次治療發放200次脈沖，頻率60次/min，震波能量0．24 mJ/mm2〔3，4〕。

1. 4 TUNEL比色法檢測心肌細胞凋亡大鼠心肌組織切片60℃烤箱中烘烤20 min，二甲苯和乙醇梯度脫蠟和水化，0．85%氯化鈉溶液浸洗5 min，PBS浸洗5 min，之后嚴格按照Dead－EndTMColorimetric TUNEL System試劑盒操作說明進行染色。蘇木素復染細胞核。切片干燥后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以細胞核染成棕黃色為陽性。每張切片在梗死邊緣區隨機取5個高倍鏡視野，記錄凋亡陽性細胞核數目，計算凋亡指數( AI)，AI( %) =凋亡細胞核數/總細胞核數×100%。

1. 5 Masson染色檢測心肌纖維化大鼠左室心肌4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋。每個心肌組織樣品連續切片3張，厚度5 μm。染色前，60℃烤箱中烘烤切片20 min，二甲苯和乙醇梯度脫蠟和水化。按Masson三色染色液說明書進行染色。顯微鏡下觀察，每張切片分別隨機選取5個HPFs (×400)進行觀察。Image－pro Plus 6．0軟件測定心肌膠原容積分數( CVF) = (膠原面積/全視野心肌總面積)×100%。

1. 6 Western印跡檢測Bax、Bcl－2、Caspase－3的表達分別取各樣本心肌組織20 mg，加入RIPA裂解液，高速電動勻漿器充分勻漿，冰上超聲破碎細胞，然后13 000 g、4℃離心5 min，取上清，BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。蛋白樣品加入等體積2×sample buffer，金屬浴95℃5 min，冷卻后4℃保存。制備SDS－PAGE，每孔蛋白上樣量50 μg，經電泳、轉膜、封閉后，一抗(抗Bax、抗Bcl－2、抗Caspase－3、抗GAPDH) 4℃孵育過夜。緩沖液洗脫后放入辣根過氧化物酶標記的二抗中，室溫孵育1 h后進行成像。以GAPDH作為內參，Image－Pro Plus 6．0軟件測定條帶灰度值，進行半定量分析。

1. 7統計學分析采用SPSS13．0統計學軟件，計量資料采用±s表示，多樣本間比較采用One－Way ANOVA，兩兩比較采用LSD法。

2結果

2. 1心肌細胞凋亡的分布經TUNEL染色及蘇木素復染細胞核后心肌凋亡細胞核呈棕黃色，正常細胞核呈藍色。MI組和CSWT組梗死邊緣區心肌細胞內出現較多棕色的細胞核碎裂顆粒。MI組和CSWT組心肌細胞凋亡指數均高于Sham組( 29．91±2．96，15．42±1．33 vs 1．30±0．41) %，而CSWT組心肌凋亡指數明顯低于MI組( 29．91±2．96 vs 15．42±1．33) %，差異均有統計學意義( P＜0．05)，見圖1。

2. 2心肌纖維化程度Masson三色染色使正常心肌染成紅色，纖維組織染成藍色。MI組心肌纖維化較Sham組和CSWT組明顯，心肌纖維排列紊亂，膠原沉積明顯。CSWT組心室肌間質膠原容積分數( 18．70±13．06) %高于Sham組( 0．31± 0．17) %，但低于MI組( 70．70±12．34) %，差異有統計學意義( P＜0．05)，見圖2。

2. 3心肌Bcl－2、Bax、Caspase－3蛋白表達Bcl－2蛋白在CSWT 組( 1．08±0．03)和Sham組( 1．02±0．02)中的相對表達量明顯高于MI組( 0．10±0．02) ( P＜0．01)。Bax蛋白在CSWT組( 0．65±0．05)與MI組( 1．10±0．10)中的相對表達量均較Sham 組( 0．30±0．01)升高( P＜0．01)，而CSWT組Bax蛋白表達較MI組則顯著下降( P＜0．01)。Caspase－3蛋白在CSWT組( 0．30±0．02)與MI組( 1．31±0．12)中的相對表達量均較Sham 組( 0．01±0．00)升高( P＜0．01)，其中CSWT組較MI組顯著下降( P＜0．01)，見圖3。

圖1 TUNEL比色法檢測心肌凋亡(×400)

圖2 Masson三色染色檢測心肌纖維化(×200)

圖3 Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相對表達量

3討論

缺血缺氧可誘導心肌細胞凋亡，存活心肌數量逐漸減少而出現左心室擴張、收縮功能減退以及左室重構，最終導致心力衰竭〔5〕。缺血缺氧等影響心肌細胞凋亡的因素主要通過死亡受體通路和線粒體通路傳遞促凋亡信號，激活凋亡相關基因的表達，包括促進細胞凋亡基因( Bax、wp53、和APO－1/Fas等)和抑制細胞凋亡基因( Bcl－2、mpl和ras等)〔6〕。其中，線粒體通路是從線粒體釋放細胞色素C開始的，受Bcl－2基因家族調控，包括凋亡抑制基因Bcl－2和凋亡促進基因bax。在急性心肌梗死患者的人體心肌組織樣本中可觀察到大量凋亡小體，并且伴有Caspase－3高表達和Bcl－2低表達〔5〕。Bax是低氧應激誘導凋亡的上游調控因子，低氧可促進Bax蛋白構象發生改變而被激活，進一步促進細胞色素C從線粒體釋放;而Bcl－2則對Bax誘導線粒體釋放細胞色素C這一過程起抑制作用。而當細胞色素C從線粒體膜空隙釋放至細胞質后可進一步激活下游Caspase－3。Caspase－3是細胞凋亡過程中的關鍵酶，也是凋亡途徑中處于中心地位的執行者，被激活后可通過激活脫氧核糖核酸酶引起DNA降解、細胞凋亡〔7〕。

目前研究認為CSWT是無創的治療缺血性心臟病的有效方法之一。該治療系統可釋放類似聚焦超聲波的低能量機械震蕩波，在心肌組織細胞間產生“空穴效應”并形成大量微氣泡，微氣泡膨脹繼而發生非球面性破裂，對周圍的心肌細胞形成快速而短暫的剪切力，誘導VEGF及其受體Flt－1、NO、IGF、IL－8等表達上調，在冠脈原有微血管床基礎上促進新生血管形成，從而改善缺血心肌的微循環及代謝〔3，8〕，減輕心室重構〔9〕。在慢性心肌缺血動物實驗中，觀察到CSWT可完全恢復左心室射血分數( LVEF)和室壁增厚率( WT)、局部心肌血流。而在豬急性心肌梗死模型中，CSWT組較對照組明顯改善其左心室射血分數〔10〕。臨床研究也顯示，CSWT可改善冠心病患者心肌灌注和心肌代謝，減輕心絞痛癥狀、減少硝酸甘油用量、改善心功能、提高運動耐量，并且具有良好安全性〔9，11〕。但CSWT對缺血缺氧心肌細胞凋亡的影響作用的研究尚少。Yu等〔12〕在體外缺氧環境下培養H9c2細胞誘導細胞凋亡，并給予CSWT處理(最大能量0．12 mJ/mm2，500次脈沖)，結果H9c2細胞凋亡減少，Bcl－2表達明顯上調，而Bax和Caspase－3表達下調。在豬急性心肌梗死模型中，CSWT治療組心肌中Bcl－2的mRNA水平上調，Bax和Caspase－3的mRNA水平下調，并且線粒體氧化應激相關蛋白的表達量也明顯降低〔13〕。而在本研究中，我們通過建立大鼠急性心肌梗死模型模擬人體急性心肌梗死的病理過程，后經CSWT治療4 w，CSWT組心肌凋亡指數及心肌纖維化程度較MI組明顯降低;蛋白水平檢測凋亡相關基因的表達變化情況發現Bcl－2表達明顯上調，而Bax和Caspase－3表達明顯下調。結果進一步提示CSWT可通過抑制線粒體通路傳遞的促凋亡信號，抑制凋亡相關基因的表達，從而減輕缺血缺氧后心肌細胞凋亡及纖維化程度。

心肌梗死發生后，梗死區及其邊緣區的心肌細胞由于缺血缺氧的刺激發生壞死和凋亡。另外，由于心功能降低，左室舒張末壓升高，室壁張力增高，心臟舒張期機械負荷加重，神經內分泌系統激活，可引起慢性、持續性氧化代謝上調，致氧化負荷增高，激活應激活化蛋白激酶，引起梗死邊緣區和非梗死區的心肌細胞凋亡〔14〕。梗死區心肌細胞凋亡是引起左心室收縮功能降低和早期重構的重要因素，而梗死邊緣區以及非梗死區的心肌細胞凋亡則主要導致晚期心功能不全和左心室重構〔15〕。本研究中CSWT組心肌梗死邊緣區心肌細胞凋亡指數較MI組明顯降低，提示CSWT治療可通過調控凋亡相關基因的表達而抑制細胞凋亡，挽救梗死邊緣區缺血缺氧的心肌細胞，從而能減輕左心室收縮功能下降和左心室重構，改善患者遠期預后。這與CSWT相關臨床研究結果相符。因此，通過CSWT體外無創物理治療方法阻斷凋亡信號轉導途徑，減少細胞凋亡及遲發性細胞壞死，可能是減少缺血區心肌細胞死亡的一條有效途徑。然而，CSWT如何調控凋亡相關基因的表達，其中的信號轉導通路仍需進一步深入探究。

4參考文獻

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〔2015－10－17修回〕

(編輯李相軍)

The effect of cardiac shock wave therapy on apoptosis of cardiomyocytes and apoptosis-related protein expression in rats with myocardial infarction

YANG Wen-Hui，GUO Tao，YANG Li，et al.
Department of Gerontology，Yan＇an Hospital Affiliated to Kunming Medical University，Kunming 650051，Yunnan，China

【Abstract】Objective To studythe effect of cardiac shock wave therapy ( CSWT) on the apoptosis of cardiomyocytes and apoptosisrelated protein expression in rats with myocardial infarction( MI) and to explore the mechanism of CSWT in ischemic cardiomyopathy．Methods Thirty healthy SD rats were divided into Sham( n=10)，MI( n=10)，CSWT groups ( n=10)．And the MI model was established by permanent ligation of the left anterior descending artery ( LAD)．After 4 weeks of CSWT treatment，myocardial samples from all groups were prepared for TUNEL and Masson staining．The expressions of Bax，Bcl－2 and Caspase－3 were detected by Western blot．Results Compared with those of sham group，the myocardial apoptosis index and the degree of fibrosis were increased obviously in MI and CSWT group．Bax and Caspase－3 expressions were increased，but Bcl－2 expression level was decreased ( P＜0．05)．Compared with those of MI group，the myocardial apoptosis index and the degree of fibrosis were decreased in CSWT group．At the same time，Bax and Caspase－3 expressions were decreased，as well as Bcl－2 expression level was increased ( P＜0．05)．Conclusions Myocardial apoptosis will be deteriorated greatly after MI of rats．However，CSWT could inhibit cardiomyocytes apoptosis and reduce fibrosis in left ventricular following MI．

【Key words】Cardiac shock wave therapy; Myocardial infarction; Apoptosis

通訊作者:郭濤( 1957－)，男，教授，博士生導師，主要從事冠心病、心律失常的基礎及臨床研究。

基金項目:國家自然科學基金資助項目( 81260027) ;云南省應用基礎研究項目( 2014FZ051)

〔中圖分類號〕R541. 4

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0265-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 004