菩人丹改善高糖波動狀態下INS-1細胞胰島素分泌功能的分子機制*

白穎慧，杜子亮，陳 書，魯碧楠，龐宗然Δ

(1.中央民族大學中國少數民族傳統醫學研究院，中國少數民族傳統醫學國家民委-教育部重點實驗室，北京 100081;2.北京市回民醫院，北京 100053)

菩人丹改善高糖波動狀態下INS-1細胞胰島素分泌功能的分子機制*

白穎慧1，杜子亮2，陳 書1，魯碧楠1，龐宗然1Δ

(1.中央民族大學中國少數民族傳統醫學研究院，中國少數民族傳統醫學國家民委-教育部重點實驗室，北京 100081;2.北京市回民醫院，北京 100053)

目的:考察菩人丹改善高糖波動狀態下INS-1細胞胰島素分泌功能的分子機制。方法:將INS-1細胞置于含33.3 mmol ·L－1和11.1 mmol·L－1葡萄糖RPMI1640培養液內12 h交替培養，持續培養5 d構建高糖波動細胞模型。分別以5%、10%菩人丹含藥血清對高糖波動狀態下INS-1細胞干預24 h，并以二甲雙胍含藥血清作為陽性對照。正常對照組細胞以含11.1 mmol·L－1葡萄糖的RPMI1640培養液進行培養。采用CCK-8試劑盒檢測細胞活力，大鼠胰島素ELISA試劑盒測定胰島素分泌量，Western blot分析IRS2、Akt、mTOR、P70s6k和PTP1B的蛋白質表達水平及磷酸化水平。結果:與正常組比較，高糖波動能夠顯著降低INS-1細胞活力及胰島素分泌量，下調INS-1細胞的IRS2蛋白質表達水平，提高IRS2磷酸化水平，降低INS-1細胞Akt、mTOR和P70s6k的磷酸化水平，上調PTP1B蛋白質表達水平。與模型組比較，菩人丹含藥血清能增加INS-1細胞活力及胰島素分泌量，上調IRS2蛋白質表達，抑制IRS2磷酸化，促進Akt、mTOR和P70s6k的磷酸化，下調PTP1B蛋白表達水平。結論:菩人丹調控高糖波動誘導的INS-1細胞IRS2、Akt、mTOR、P70s6k和PTP1B的蛋白質表達水平及磷酸化水平，改善高糖波動狀態下胰島β細胞胰島素分泌功能。

INS-1細胞;高糖波動;胰島素分泌;菩人丹;IRS2-PI3K/Akt

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的主要病理表現是糖脂代謝紊亂，而血糖水平的急性改變是T2DM患者糖代謝紊亂的重要形式。研究已證實［1-3］，高糖狀態下的血糖波動通過激活氧化應激、炎癥通路等方式，導致胰島β細胞數量異常減少和胰島素分泌功能的下降，致使胰島β細胞無法分泌足夠的胰島素以調節機體血糖穩態，從而加速T2DM的發生發展。因此，保護高糖波動(fluctuatedhigh glucose，FG)狀態下胰島β細胞功能，是減緩T2DM病程的基礎。本實驗以大鼠胰島素瘤細胞系INS-1細胞為研究對象，體外模擬高糖波動狀態下胰島β細胞分泌功能的變化，考察中藥降糖復方菩人丹(Pu Ren Dan，PRD)對胰島β細胞胰島素分泌的影響，并以胰島素受體底物2/磷酸肌醇-3激酶/蛋 白 激 酶 B (insulin receptor substrate 2/ phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，IRS2-PI3K/Akt)信號通路為切入點，探討菩人丹改善糖波動狀態下INS-1細胞胰島素分泌功能的分子機制。

1 實驗材料

1.1 動物及細胞株

大鼠胰島素瘤細胞系INS-1細胞株，購自協和醫科大學細胞中心;SPF級雄性Wistar大鼠90只，8周齡，體質量300 g左右，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(SCXK-軍2007-004)。

1.2 主要藥品及試劑

人參(亞威中藥飲片有限公司)、丹參(金香中藥飲片有限公司)、葛根(金香中藥飲片有限公司)、制何首烏(亞威中藥飲片有限公司)、制水蛭(金香中藥飲片有限公司)、苦瓜凍干粉(諾金科生物技術有限公司)、鹽酸二甲雙胍片(雙鶴藥業)、Cell Counting Kit-8(CCK-8)(DOJINDO同仁化學研究所)、大鼠胰島素ELISA試劑盒(RD Biosciences公司)、p-IRS2(ser731)、IRS2、p-Akt(thr308)、p-mTOR (ser2448)、p-P70s6k(thr389)(CellSignaling Technology公司)、PTP1B(Millipore公司)。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設備有限公司)，血球計數板(上海求精公司)，多功能酶標儀(美國分子儀器公司)，Bio-Rad電泳儀(美國伯樂儀器有限公司)，水平脫色搖床(江蘇其林貝爾儀器有限公司)，濕轉電泳槽(北京凱元信瑞儀器有限公司)，Fresco低溫冷凍離心機(美國 Thermo Scientific公司)。

1.4 菩人丹含藥血清制備

1.4.1 中藥菩人丹制備 菩人丹降糖方由苦瓜、人參、丹參、制首烏、葛根及水蛭組成。將人參、丹參、制首烏、葛根及水蛭以冷水浸泡過夜后，加8倍水回流提取2次，時間為1.5、1 h，其中人參單獨提取，余藥材一并提取，收集提取液過濾后合并，于旋轉蒸發儀中濃縮。取苦瓜凍干粉加入之前藥材濃縮液中，蒸餾水補齊，制備濃度相當于生藥量7.21 g ·mL－1的菩人丹。

1.4.2 菩人丹含藥血清制備 取SPF級雄性Wistar大鼠90只，8周齡，體質量(300 g±10 g)，大鼠適應性喂養1周后，將大鼠按隨機數字表法分為3組，即菩人丹組30只，二甲雙胍陽性對照組30只和空白對照組30只，各組均飼以普通維持飼料。根據前期研究結果［8-13］，確定大鼠給藥體質量劑量為正常給藥劑量的10倍，即菩人丹組以144.2 g(生藥)·kg－1·d－1水煎液灌胃，二甲雙胍陽性對照組以1.4 g·kg－1·d－1的二甲雙胍0.5%CMC-Na乳濁液灌胃;空白對照組以0.5%CMC-Na溶液灌胃。各組大鼠的灌胃體積為10 mL·kg(體質量)－1，每日給藥2次(間隔12 h)，連續給藥5 d。第5天首次給藥(即第9次給藥)后1 h，腹腔注射10%水合氯醛(體質量劑量3 mL·kg－1)麻醉大鼠，腹主動脈取血，血樣室溫靜置3 h，3500 rpm離心15 min取上清，分別將各組大鼠血清混合，56℃水浴滅活30 min，一次性無菌微孔濾膜(0.22 μm)過濾滅菌，分裝后－80℃保存備用。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

INS-1細胞在完全RPMI1640培養液(含10%胎牛血清，葡萄糖11.1 mmol·L－1，1 mmol·L－1丙酮酸鈉，2 mmol·L－1L-谷氨酰胺，10 mmol·L－1HEPES，50 μmol·L－1β-巰基乙醇，100 kU/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)中培養，每3 d更換1次培養基，待細胞處于對數生長期后予以傳代。

2.2 模型復制及分組

取同代 INS-1細胞置于含33.3 mmol·L－1和11.1 mmol·L－1葡萄糖的RPMI1640培養液內12 h交替培養，持續培養5 d。將INS-1細胞等密度接種于培養板中，待細胞完全貼壁后隨機分組并進行干預:正常對照組(Control組，常規 RPMI1640中培養)、高糖波動模型組(FG組，高糖RPMI1640培養液與常規RPMI1640中交替培養5 d，每12 h交替，后以常規RPMI1640培養24 h)、菩人丹藥物血清高劑量組(H-PRD組，FG組細胞中加入終濃度10%的菩人丹含藥血清常規RPMI1640培養液干預24 h)、菩人丹藥物血清低劑量組(L-PRD組，FG組細胞中加入終濃度5%的菩人丹含藥血清常規RPMI1640培養液干預24 h)、二甲雙胍藥物血清對照組(MF組，FG組細胞中加入終濃度10%的二甲雙胍含藥血清培養液干預24 h)。

2.3 細胞活力檢測

收集對數生長期的INS-1細胞，將細胞濃度調整至1×105cells·mL－1并接種于96孔板，每孔200 μL，于5%CO2、37℃恒溫濕化培養箱中培養。各組細胞干預結束后按照CCK-8試劑盒說明書操作，酶標儀測定450 nm處的吸光度(A)，以Control組A為對照，按照干預組A/正常組A×100%計算各組細胞活力。

2.4 葡萄糖刺激的胰島素釋放實驗

將INS-1細胞按2×105/孔的密度接種于24孔板中培養到80%～90%融合，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍后，加入含有3 mmol·L－1葡萄糖的Krebs-Ringer HEPES緩沖液(KRBH緩沖液，含有 115 mmol·L－1氯化鈉，24 mmol·L－1碳酸氫鈉，5 mmol· L－1氯化鉀，1 mmol·L－1氯化鎂，25 mmol·L－1HEPES，0.5%BSA，pH 7.4)，在37℃下平衡20 min棄去上清，分別加入含3 mmol·L－1或20 mmol·L－1葡萄糖的KRHB緩沖液，37℃孵育20 min，小心吸取上清液(注意盡量不要吸到細胞)后4℃離心800 rpm，5 min，收集上清后采用ELISA法測定胰島素分泌量。相應的細胞加200 μL細胞裂解液，BCA法測每組細胞總蛋白含量。每組實驗均設復孔，重復3次。通過總蛋白含量對胰島素釋放量進行校正，計算出各組細胞的基礎胰島素分泌(basal insulin secretion，BIS)和葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)。

2.5 Western blot分析

利用western blot分析檢測胰島素受體底物2 (insulin receptor substrate 2，IRS2)、蛋白激酶 B (protein kinase B，Akt)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、40S核糖體S6蛋白激酶(P70 ribosomal protein S6 kinases，P70s6k)和蛋白質酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)的蛋白質表達水平及磷酸化水平。收集各組細胞，按RIPA蛋白抽提試劑盒說明抽取各組細胞總蛋白，用BCA法檢測蛋白質濃度。制備蛋白樣品轉膜、封閉，置于一抗(p-IRS2 (ser731)1∶1000、IRS 1∶1000、p-Akt(thr308)1∶1000、p-mTOR(ser2448)1∶2000、p-P70s6k(thr389)1∶1000、PTP1B 1∶4000)中4℃過夜，次日置于二抗(1∶20000)中，搖床上室溫孵育40 min，ECL發光顯色，Bio-Rad圖像分析系統對Western印跡目的條帶進行掃描，然后用Quantity One軟件分析目的條帶光密度值與內參條帶光密度值的比值來評估結果。

2.6 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行統計分析，正態分布資料以均數±標準差(±s)表示，2組間比較采用兩樣本均數的t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 菩人丹對高糖波動狀態下INS-1細胞的活力檢測

圖1顯示，采用CCK-8試劑盒測定細胞活力，結果顯示INS-1細胞在含33.3 mmol·L－1葡萄糖的培養液和含11.1 mmol·L－1葡萄糖的培養液中培養5 d后，細胞活力顯著降低，以常規培養液培養的INS-1細胞(細胞活力為100%)為對照，FG組細胞活力下降至(57.40% ±5.32%，P＜0.001)。分別給予低劑量(5%)和高劑量(10%)菩人丹含藥血清對高糖波動損傷INS-1細胞進行24 h干預，結果LPRD組與FG組的細胞活力比較差異無統計學意義(60.40%±3.58%，P=0.275)，但H-PRD組作用24 h后，INS-1細胞活力較 FG組細胞明顯升高(80.00%±4.12%，P＜0.001)。

圖1 菩人丹對高糖波動狀態下INS-1細胞的活力檢測注:與FG組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

3.2 菩人丹對高糖波動狀態下INS-1胰島素分泌功能的影響

圖2顯示，利用ELISA方法對INS-1細胞的胰島素分泌量進行檢測。實驗結果顯示，與正常對照組比較，INS-1細胞的基礎胰島素分泌量(BIS)由(0.77±0.07)μU/mg/h下降至(0.522±0.065) μU/mg/h(P＜0.001)，葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)則由(1.908±0.085)μU/mg/h降低至(0.61±0.117)μU/mg/h(P＜0.001);低劑量菩人丹干預24 h后，INS-1細胞的BIS與FG組比較無明顯改變，但GSIS顯著升高(0.826±0.065 μU/mg/ h，P=0.009);高劑量即菩人丹可以明顯增加INS-1細胞的胰島素分泌量，BIS增加至(0.692±0.006) μU/mg/h(P＜0.001)，GSIS增加至(1.21±0.123) μU/mg/h(P＜0.001)。

圖2 菩人丹對高糖波動狀態下INS-1細胞胰島素分泌功能的影響注:與FG組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

3.3 菩人丹對INS-1細胞IRS2、Akt、mTOR、P70s6k和PTP1B的蛋白質表達水平及磷酸化水平的影響

3.3.1 菩人丹對高糖波動狀態下INS-1細胞IRS2蛋白質表達及磷酸化的影響 圖3顯示，與Control組比較，FG組INS-1細胞的IRS2蛋白質表達水平明顯下調(63.00% ±4%，P＜0.001)，菩人丹則能顯著上調高糖波動狀態下損傷INS-1細胞的IRS2蛋白質表達水平，菩人丹干預組細胞的IRS2蛋白質表達水平與FG組比較升高(86.00%±4%，P＜0.001);與Control組比較，FG組IRS2(ser731)磷酸化水平升高(318.00% ±18%，P＜0.001)，菩人丹作用24 h后，損傷INS-1細胞IRS2(ser731)磷酸化水平顯著降低(72.00%±3%，P＜0.001)。

圖3 菩人丹對高糖波動狀態下INS-1細胞IRS2蛋白質表達及ser731位點磷酸化的影響注:與FG組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

圖4 菩人丹對高糖波動狀態下INS-1細胞Akt(thr308)磷酸化的影響注:與FG組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

圖5 菩人丹對高糖波動狀態下INS-1細胞mTOR(ser2448)和P70s6k(thr389)磷酸化的影響注:與FG組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

圖6 菩人丹對高糖波動狀態下INS-1細胞PTP1B蛋白表達水平的影響注:與FG組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

3.3.2 菩人丹對高糖波動狀態下INS-1細胞Akt(thr308)磷酸化的影響 圖4顯示，高糖波動狀態下Akt蘇氨酸308位點磷酸化水平明顯降低，與Control組比較，FG組Akt(thr308)磷酸化水平下降(62%±2%，P＜0.001)。菩人丹可上調INS-1細胞Akt(thr308)磷酸化水平，促進Akt活化。菩人丹作用24 h后，FG損傷細胞的Akt(thr308)磷酸化水平升高(70%±1%)。

3.3.3 菩人丹對高糖波動狀態下INS-1細胞mTOR(ser2448)和P70s6k(thr389)磷酸化的影響圖5顯示，高糖波動狀態下 INS-1細胞 mTOR (ser2448)的磷酸化水平顯著下降，FG組 mTOR (ser2448)磷酸化水平較 Control組下降(30% ± 5%，P＜0.001)，菩人丹作用24 h后，INS-1細胞mTOR(ser2448)磷酸化水平上調(48%±8%，P= 0.006)。作為mTOR效應因子的P70s6k，其thr389位點的磷酸化在高糖波動狀態下被顯著抑制;與Control組比較，FG組P70s6k(thr389)磷酸化水平下降(14%±4%，P＜0.001)，菩人丹作用24 h后，FG組細胞 P70s6k(thr389)磷酸化水平均顯著升高(58%±6%，P＜0.001)。

3.3.4 菩人丹對高糖波動狀態下INS-1細胞PTP1B蛋白質表達的影響 圖6顯示，高糖波動狀態下，INS-1細胞的PTP1B蛋白質表達顯著上調，與control組比較，FG組 PTP1B蛋白質表達水平(126%±8%，P=0.002)，菩人丹作用24 h后，FG損傷細胞PTP1B蛋白表達水平下調(64%±10%，P＜0.001)。

4 討論

血糖波動不僅是糖尿病慢性并發癥重要的獨立危險因素，而且與胰島β細胞功能密切相關。研究發現，血糖水平波動較大時β細胞功能減低明顯高于較小的血糖水平波動，提示胰島β細胞功能損害的嚴重程度與血糖波動幅度的大小有關。邱平等［10］通過體外實驗證明，波動性高糖可顯著降低細胞的GSIS，并推測其機制可能涉及線粒體氧化應激損傷。課題組前期研究也證實了波動性高糖對胰島β細胞的損傷作用［6］。

IRS2是維護胰島β細胞功能的關鍵信號蛋白。Hennige等［11］發現，小鼠β細胞內IRS2表達增加可以促進β細胞生長、存活和改善其胰島素分泌功能。本實驗發現，高糖波動狀態下INS-1細胞的IRS2蛋白表達水平顯著降低，這可能是與高糖波動狀態下IRS2的異常降解有關。同時我們發現，IRS2絲氨酸731位點磷酸化水平卻明顯增高，這可能是由于高糖波動狀態抑制蛋白酪氨酸激酶的活化，而菩人丹干預后INS-1細胞的IRS2蛋白質表達水平明顯升高，IRS2絲氨酸731位點磷酸化水平明顯下降，說明菩人丹能有效抑制IRS2蛋白降解和IRS2蛋白731位點絲氨酸磷酸化，從而修復高糖波動狀態下INS-1細胞的胰島素信號傳導障礙。

AKT分子通過不同的下游底物調節胰島β細胞大小、數量、細胞內的基因轉錄以及細胞分泌功能［12］。本實驗發現，在高糖波動狀態下Akt蘇氨酸308位點磷酸化水平明顯降低，進而使INS-1細胞胰島素分泌功能下降。

mTOR是磷脂酰肌醇相關蛋白激酶(PIKK)的家族成員，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，可以響應細胞外信號，激活下游效應因子，參與基因轉錄、蛋白質翻譯等過程，以調節β細胞生存、增殖及蛋白質合成。P70s6k是mTOR的下游靶蛋白，是mTOR效應因子中研究最廣泛的，P70s6k的Thr389磷酸化被認為是mTOR激活的鏡子［13］。本實驗觀察到，在高糖波動狀態下INS-1細胞mTOR和P70s6k活性均受到抑制，mTOR(ser2448)和P70s6k(thr389)磷酸化水平均顯著降低。而菩人丹干預后，mTOR和P70s6k的磷酸化水平均明顯升高，提示菩人丹可通過促進 Akt和 mTOR的磷酸化水平進而活化P70s6k，使細胞總體蛋白質翻譯水平升高，從而促進INS-1細胞的增殖。

PTP1B可在胰島素信號級聯中的多個位點發揮負調控作用，過度表達PTP1B能增加胰島素受體、胰島素受體底物的脫磷酸化，并下調受體后信號，從而引起胰島素信號傳導障礙并引發胰島素抵抗甚至T2DM。研究表明［14］，敲除PTP1B基因后，小鼠胰島素敏感性顯著增強，即使在高脂高熱卡飲食環境下，小鼠也不出現肥胖或胰島素抵抗，若重新表達PTP1B，原本增強的胰島素敏感性則會出現顯著減弱。本實驗證實，在高糖波動狀態下，INS-1細胞PTP1B蛋白質表達水平顯著上調，而菩人丹干預后細胞PTP1B蛋白質表達水平下降，說明菩人丹部分抑制PTP1B對胰島素信號傳導的負性調控，從而改善INS-1細胞IRS2/PI3K/Akt信號傳導。

前期研究表明，菩人丹具有降糖、調脂、減輕胰島素抵抗、抑制胰島β細胞凋亡、保護胰島β細胞功能的作用［4-9］。本實驗在此基礎上，進一步考察了菩人丹對高糖波動胰島β細胞胰島素分泌功能的影響，揭示了菩人丹通過調控IRS2/PI3K/Akt信號通路中IRS2、Akt、mTOR/P70s6k和PTP1B蛋白質表達水平及其磷酸化水平，改善胰島β細胞分泌功能的分子機制，為菩人丹修復胰島β細胞損傷，防治T2DM的臨床應用提供了實驗依據。

［1］HOU，Li HL，ZHAO JJ，et al.Impairment of pancreatic islet beta cell function induced by intermittent high glucose through oxidative and endoplasmic reticulum stress:experiment with rat pancreatic islet beta cells［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88(28):2002-2004.

［2］ SYEDA K，MOHAMMED A M，ARORA D K，et al.Glucotoxic conditions induce endoplasmic reticulum stress to cause caspase 3 mediated lamin B degradation in pancreatic beta-cells:protection by nifedipine［J］.Biochem Pharmacol，2013，86(9):1338-1346.

［3］KIM M，CHUNG H，YOON C，et al.Increase of INS-1 cell apoptosis under glucose fluctuation and the involvement of FOXOSIRT pathway［J］.Diabetes Res Clin Pract，2012，98(1):132-139.

［4］龐宗然，趙玉堂，李靜華，等.菩人丹超微粉對肥胖型2型糖尿病大鼠糖代謝相關指標的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16(5):107-110.

［5］金英，魯碧楠，劉祖涵，等.菩人丹對T2DM大鼠胰島β細胞分泌功能及胰島素敏感性的影響［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2012，18(10):1090-1092.

［6］魯碧楠.菩人丹對糖脂毒導致的INS-1細胞損傷的修復作用及機制研究［D］.北京:中央民族大學，2013.

［7］杜子亮，魯碧楠，陳書，等.菩人丹對高糖誘導的INS-1細胞凋亡、BAD和FOXO1蛋白表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19(22):173-177.

［8］ 陳書，魯碧楠，杜子亮，等.菩人丹調控IRS2、BAD、FOXO1蛋白表達和磷酸化抑制INS-1細胞凋亡的分子機制［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2013，19(11):1341-1344.

［9］魯碧楠，蘇占輝，蘇曉慧，等.菩人丹超微粉對T2DM大血管損傷大鼠骨骼肌IRS-1，GLUT-4，PI-3K，NF-κB蛋白表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19(9):210-214.

［10］邱平，趙鐵耘，李秀鈞，等.間斷高濃度葡萄糖對胰島β細胞的損傷機制研究［J］.四川大學學報:醫學版，2008，39 (6):69-71，93.

［11］ HENNIGE A M，SARTORIUS T，TSCHRITTER O， et al.Tissue selectivity ofinsulin detemiraction in vivo［J］.Diabetologia，2006，49(6):1274-1282.

［12］MIAO X Y，GU Z Y，LIU P，et al.The human glucagon-like peptide-1 analogue liraglutide regulatespancreatic beta-cell proliferation and apoptosis via an AMPK/mTOR/P70S6K signaling pathway［J］.Peptides，2013，39:71-79.

［13］李小明，楊作成，陳淳媛，等.mTOR/p70S6K信號通路與NIH3T3成纖維細胞增殖［J］.現代預防醫學，2008，35 (18):3582-3584.

［14］PANZHINSKIY E，REN J，NAIR S. Protein tyrosine

phosphatase 1B and insulin resistance:role of endoplasmic reticulum stress/reactive oxygen species/nuclear factor kappa B axis［J］.PLoS One，2013，8(10):e77228.

Purendan Improving the Molecular Mechanism of Ins-1 Cell Insulin Secretion under High Glucose Fluctuation

BAI Ying-hui1，DU Zi-liang2，CHEN Shu1，LU Bi-nan1，PANG Zong-ran1Δ
(1.Institute of Chinese Minority Traditional Medicine，Mizu University of China.Key Laboratory for Chinese Minority Traditional Medicine of Ministry of Education，Beijing 100081，China;2.The Moslem Hospital of Bejing，Beijing 100053，China)

Objective:To study the molecular mechanism of Pu Ren Dan improving the secretion function of INS-1 cell under fluctuated high glucose.Methods:INS-1 cell was cultured in high glucose RPMI1640 medium containing 33.3 mmol ·L－1glucose and conventional RPMI1640 medium containing 11.1 mmol·L－1glucose each 12 hours for 5 days to induce fluctuated high glucose cell model.INS-1 cell was intervened in 5%and 10%drug serum containing PRD for 24 hours as PRD experimental group，drug serum containing Metformin as the positive control group.The INS-1 cell in the normal control group was cultured in RPMI1640 medium containing 11.1 mmol·L－1glucose.Using CCK-8 kit to detect cell viability，ELISA to test the insulin secretion of INS-1 cell，Western blot assay to test proteins expression and phosphorylation levels of IRS2，Akt，mTOR，P70s6k，PTP1B.Results:Compared with the control group，cell viability and insulin secretion level of INS-1 cell in FG decreased significantly.Protein expression level of IRS2 decreased，phosphorylation of IRS-2 increased;phosphorylations of Akt，mTOR and P70s6k lowered significantly;while the protein expression level of PTP1B increased.Compared with the model group，cell viability and insulin secretion level of INS-1 cell in PRD experimental group increased significantly.Protein expression level of IRS2 increased，phosphorylation of IRS2 lowered;phosphorylations of Akt，mTOR and P70s6k increased significantly;while the protein expression level of PTP1B decreased.Conclusion:Pu Ren Dan regulates the protein expression and phosphorylation levels of IRS2，Akt，mTOR，P70s6k and PTP1B of INS-1 cell induced by fluctuated high glucose，improving the insulin secretion function of INS-1 cell under fluctuated high glucose.

INS-1 cell;Fluctuated High Glucose;Insulin secretion;Pu Ren Dan;IRS2-PI3K/Akt

R285.5

B

1006-3250(2016)12-1620-05

2016-05-27

國家自然科學基金資助項目(81072963)-菩人丹超微粉調控PTP1B蛋白與IRS2/PI3K/Akt信號轉導改善胰島β細胞形態與功能的作用機制;國家自然科學基金青年基金項目(81302946)-基于IR信號轉導系統的菩人丹修管T2DM胰島β細胞損傷作用靶點研究

白穎慧(1991-)，女，河南新密人，在讀碩士，從事2型糖尿病發病機制及其傳統醫藥干預研究。

△通訊作者:龐宗然(1966-)，男，研究員，博士研究生導師，從事糖尿病及其并發癥發病機制與中醫藥干預研究，Tel: 010-68935090，E-mail:zrpang@163.com。