130例β-地中海貧血基因突變類型分析

何琳琳

(荊門市第一人民醫院，湖北 荊門　448000)

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130例β-地中海貧血基因突變類型分析

何琳琳

(荊門市第一人民醫院，湖北 荊門448000)

[摘要]目的：研究分析β-地中海貧血基因突變類型。方法：以2012年4月至2015年1月來我院診治的130例攜帶β-地中海貧血基因患者作為研究對象，采取聚合酶鏈反應以及反向點雜交技術對患者實施基因分型，觀察分析β-地中海貧血患者基因突變情況。結果：130例攜帶β-地中海貧血基因者中，大部分為嬰兒和青少年，有100例為雜合子，6例為純合子，24例為雙重雜合子。突變基因中以TVS-2-654和CD41～42最為常見。結論：β-地中海貧血基因突變類型比較復雜，同時遺傳異質性較為顯著，在今后地中海貧血遺傳咨詢以及產前診斷時，應加強該基因突變類型的檢測以及篩查，從而為優生優育提供更為合理且全面的指導。

[關鍵詞]突變；β-地中海貧血；基因

所謂β-地中海貧血是指β鏈合成完全被抑制或者部分受抑制的血紅蛋白疾病，多發于嬰兒期，其中出生后3～6個月發病者所占比例占1/2。據調查，該病發病年齡越早則患者病情越嚴重，需依靠定期輸血維持生命[1-2]。在β-地中海貧血臨床診斷中可結合患者臨床癥狀表現與血液檢查確診。目前在β-地中海貧血臨床中尚無有效治療方法，因此加強產前基因和攜帶β-地中海貧血基因者的篩查、檢查診斷成為目前提升人口素質的有效措施之一[3]。本次研究就本地區攜帶β-地中海貧血基因者基因突變類型進行研究分析。

1資料和方法

1.1一般資料本次研究血樣來源于2012年4月至2015年1月到本院予以診治的130例攜帶β-地中海貧血基因患者，血樣間沒有親緣關系。患者中：男70例，女60例；年齡20天至64歲。所有患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2主要儀器及試劑血細胞自動分析儀(XS-800i，由日本希美康公司生產)、PCR儀(由德國Eppendorf公司生產)、ABI30130程序儀(由美國Applied Biosystems公司生產)、高效液相色譜儀(由美國BIO-RAD生產)、DNA快速提取試劑盒、膠回收試劑盒、β-地中海貧血基因檢測試劑盒以及Taq酶，其中DNA快速提取試劑盒和β-地中海貧血基因檢測試劑盒由深圳益生堂生物企業有限公司生產，膠回收試劑盒由德國Qiagen公司生產，Taq酶由大連TaKaRa公司生產。

1.3方法采集血樣的時候，對所選對象祖籍和婚姻情況進行考證。采集靜脈血，利用乙二胺四乙酸實施抗凝，且利用DNA快速提取試劑盒進行DNA基因的提取，嚴格按照說明書和操作流程執行。檢查診斷主要包含以下2方面：(1)β-地中海貧血基因。采用RDB法(反向斑點雜交)根據試劑盒操作說明書進行操作，其中PCR反應體系，DNA模板為3 μL，總體積為50 μL，Tap酶為2 μL，含有PCR混合液45 μL。反應條件，94 ℃分別5 min和1 min，55 ℃為30 s，72 ℃分別為60 s和5 min，儲存溫度4 ℃。利用2%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳，查看是否存在特征性條帶。PCR產物經雜交膜條斑點顯色明確基因型，其中正常斑點完全顯色同時未發生異常突變的斑點一同顯色表示正常基因型，若突變斑點和其相應的正常斑點一同顯色則表示基因突變型。(2)罕見β-地中海貧血基因。對于沒有檢測出常見β-地中海貧血突變血樣，對β-珠蛋白基因全長進行擴增。β-珠蛋白引物為上海生工生物工程技術服務有限公司合成。其中PCR反應體系，DNA模板為2 μL，總體積為50 μL，Tap酶為0.5 μL，無菌蒸餾水為36.5 μL，引物為1 μL,含有10×PCR buffer 5 μL。反應條件，95 ℃分別5 min與1 min，55 ℃為30 s，而72 ℃分別為90 s和10 min，儲存溫度為4 ℃。利用1%瓊脂糖凝膠PCR產物進行電泳，查看是否存在目的條帶。對于沒有檢測出常見β-地中海貧血突變的血樣，經PCR擴增以及純化以后直接測序，將擴增β-珠蛋白基因全長引物作為測序引物，將提純PCR產物當作模板，借助于DNA全自動序列分析儀實施序列測定，接著基于兩端測出序列。而后設中間段測序引物，并再次實施測序反應，以獲得β-珠蛋白基因者整個全長序列。

1.4統計學方法利用Excel錄入整理研究數據，并用SPSS17.0軟件對數據予以統計學處理和分析。根據本次研究需求，采取描述性法，分析β-地中海貧血基因突變。

2結果

130例攜帶β-地中海貧血基因者中，年齡在20 d至1歲的有60例，年齡在2～18歲的有40例，超過18歲的有30例。攜帶β-地中海貧血基因者中有100例為雜合子，占76.9%；6例為純合子，占4.6%；24例為雙重雜合子，占18.5%。經比較分析，雜合子基因突變所占比重和純合子、雙重雜合子相比較明顯要高(P<0.05)。β-地中海基因突變類型頻率分布與表型如表1所示。

表1　β-地中海基因突變類型頻率分布與表型

注：β0為β珠蛋白肽鏈合成缺失；—表示沒有證實；β+為β珠蛋白肽鏈合成減少

經過表1數據的分析可知，IVS-2-465和CD41～42出現頻率為最高，其次是CD17、-28，其中IVS-2-465、CD41～42和其他基因突變出現頻率相比較有顯著性差異(P<0.05)。經DNA測序，由于β-基因外顯子2-的36位編碼氨基酸缺失一個堿基C，造成蛋白質翻譯終止于第60位，因此出現了一種新基因突變，即CD36。

3討論

在臨床中，β-地中海貧血屬于遺傳性溶血性貧血疾病，該病多發于嬰兒期，癥狀表現不明顯，隨著年齡的增長，骨骼會發生變化，出現眼距增寬、特殊面容(頭大、鼻梁低陷、額部突起以及兩顴略高)、眼瞼水腫、生長發育停滯、皮膚斑狀色素沉著、肝脾大以及食欲不振等現象，大部分患者在5歲之前死亡[4]。經研究調查和文獻報道分析認為β-地中海貧血主要是因β-珠蛋白基因存在缺陷所引起，且多為點突變，部分為缺失β-珠蛋白基因。有學者將基因缺失以及點突變造成β鏈生成全部受抑制的叫作β0-地中海貧血，將點突變以及基因缺失造成β鏈生成部分受抑制的叫作β+-地中海貧血[5]。據調查資料顯示，全球大約有9 000萬人攜帶該病基因，同時每年大約有20萬雙重雜合子或者純合子基因型β-地中海貧血新生兒出生[6]。

本次研究選擇130例攜帶β-地中海貧血基因患者作為研究對象，其中以嬰兒和青少年占多數。就基因突變情況來看，雜合子患者表型主要為靜止型，即攜帶者，能遺傳給后代，對此，在預防以及控制β-地中海貧血時，需著重加強攜帶血的檢測以及篩查。同時本次研究結果還表明，IVS-2-465和CD41～42突變頻率較高，這2種突變類型比較常見，其中：IVS-2-465突變于內含子第654堿基出現C-T堿基置換，造成mRNA加工發生異常，使β珠蛋白翻譯受影響；CD41～42突變于β基因41～42 密碼子位置缺失堿基共4個，導致閱讀框架發生變化，使終止密碼提前出現，造成β珠蛋白鏈合成全部受抑制。對此，在β-地中海貧血疾病預防中，應著重預防IVS-2-465突變與CD41～42突變。除此之外，本次研究還發現有CD36突變，表明本地區β-地中海貧血基因突變比較多樣，同時遺傳異質性明顯，從該結果來看，本地區β-地中海貧血基因多樣性以及明顯異質性具備自身特點。

綜上所述，β-地中海基因突變類型非常多，在疾病控制以及預防過程中，應加強關于地中海貧血方面的知識宣教，加強產前診斷、人群篩查以及遺傳咨詢，降低該病重癥患兒的出生，以此減輕家庭負擔以及社會負擔。除此之外，在今后β-地中海疾病的控制以及預防中，還應注意未知基因突變的檢測以及篩查，獲得更多有關基因多態性和基因突變遺傳信息，闡明各種基因突變類型病理機理，以此為優生優育工作的開展提供相應的指導，繼而進一步提升人口素質。

參考文獻：

[1]BABAMETO L A,MITRE A,BERISHA S,et al.Molecular Genetic Characterization of β-Thalassemia and Sickle Cell Syndrome in the Albanian Population[J].Balkan J Med Genet,2011,14(1):45-50.

[2]李莉艷，李強，宋蘭林，等.69例α β復合型地中海貧血的血液學和基因型研究[J].實用婦產科雜志，2011，27(5)：378-382.

[3]孫順昌，周指明，宋慧文，等.輕型β-珠蛋白生成障礙性貧血患者β-珠蛋白基因( AC)n(AT)x Ty多態性分析[J].中華檢驗醫學雜志，2012，35(1)：32-36.

[4]李東明，胡雪樺，黃戰，等.β-地中海貧血表型兒童地中海貧血基因突變分析[J].中國婦幼保健，2015，30(3)：370-372.

[5]劉貴建，孫士鵬.地中海貧血的實驗診斷:項目和方法的選擇及臨床應用評價[J].中華檢驗醫學雜志，2012，35(5)：385-389.

[6]VYSSOULIS G, KARPANOU E, KYVELOU S M, et al. Ambulatory blood pressure profile in hypertensive patients with β-thalassemia minor[J]. Hypertens Res, 2011, 34(2): 253-256.

(收稿日期：2015-07-01)

[中圖分類號]R556.6+1

[文獻標識碼]A

DOI:10.11851/j.issn.1673-1557.2016.02.013

優先數字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20160311.2002.002.html

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