異戊烯焦磷酸擴增成人外周血以及臍帶血γδT細胞效能比較

任樹華，馮　玲，喻梅星，柳　怡，顏　焰，楊　凡

(1.成都市錦江區(qū)婦幼保健院產科，四川 成都　610021；

2.四川大學華西第二醫(yī)院兒科，四川 成都　610041；

3.四川大學華西第二醫(yī)院-香港大學醫(yī)學院醫(yī)學聯(lián)合研究中心，四川 成都　610041)

?

異戊烯焦磷酸擴增成人外周血以及臍帶血γδT細胞效能比較

任樹華1，馮玲2，喻梅星3，柳怡1，顏焰1，楊凡2

(1.成都市錦江區(qū)婦幼保健院產科，四川 成都610021；

2.四川大學華西第二醫(yī)院兒科，四川 成都610041；

3.四川大學華西第二醫(yī)院-香港大學醫(yī)學院醫(yī)學聯(lián)合研究中心，四川 成都610041)

[摘要]目的：研究異戊烯焦磷酸(IPP)擴增成人外周血以及臍帶血γδT細胞效能比較。方法：梯度離心法分離成人外周血以及臍帶血淋巴細胞，分別加入IL-2和IPP，在10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)體系下，刺激培養(yǎng)不同時間，用流式細胞儀檢測2種標本被刺激后γδT細胞增殖比例。結果：IL-2加IPP擴增后成人外周血γδT細胞在淋巴細胞中比例上升為73.05%±2.92%；臍帶血組擴增后γδT細胞在淋巴細胞中比例上升為38.66%±5.14%；不同來源的γδT細胞的在相同質量分數(shù)和時間刺激下擴增的效率有顯著性差異。相同的擴增條件下，成人γδT細胞增殖峰值在第14天，而足月兒的擴增峰值延遲到第18天。結論：臍帶血來源的γδT細胞對IPP抗原刺激反應較弱，可能是新生兒早期天然免疫力低下的原因之一。

[關鍵詞]γδT細胞；異戊烯焦磷酸；新生兒；臍帶；血液

近年來報道，感染是新生兒致死的主要原因之一，而低下的免疫功能是新生兒易患高致死性感染性疾病的主要原因[1]。對于新生兒而言，其抗原提成細胞(DC細胞等)的不成熟以及孕期Th1主導的免疫環(huán)境一直延續(xù)到出生后數(shù)月將會抑制適應性免疫應答[2]。因此天然免疫功能對于新生兒至關重要。

γδT細胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型天然免疫細胞，它不同于傳統(tǒng)的αβT細胞，而是擁有γδ鏈的天然免疫細胞。γδT細胞不僅有高效的抗病毒和吞噬等典型的天然免疫功能，同時還可以作為特殊APC細胞進一步活化適應性免疫應答[3]。雖然γδT細胞有強大的橫跨天然和適應性免疫應答的功能，但是γδ在成人外周血中的數(shù)量僅有2%～12%，而在臍帶血中的比例更少。數(shù)量少成為制約其發(fā)揮功能的主要問題。如何在急性感染侵襲時產生大量的γδT細胞發(fā)揮免疫作用已經成為亟需解決的問題。有報道發(fā)現(xiàn)IPP抗原能與γδ細胞的TCR受體結合從而刺激γδT細胞的大量增殖，但是對于臍帶血來源的γδ細胞目前研究甚少。本試驗致力于比較IPP對于成人外周血和臍帶血來源的γδT細胞的擴增效能，從而提供IPP用于高效擴增臍帶血γδT 細胞臨床應用的初期試驗依據(jù)。

1對象與方法

1.1標本的采集和PBMC的制備2011—2012年來自成都血液中心新鮮成人外周血4例，每例400 mL，經過分離處理后得到血液白膜層15 mL。白膜層加入PBS稀釋，經過Ficoll-Hypaque分離白膜層，400 G，10 min梯度離心得到PBMC8×107細胞/例。2012年來自錦江區(qū)婦幼保健院產科正常新鮮足月兒臍帶血4例，每例100 mL，處理同前。

1.2IPP刺激作用使用10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中加入9 μg/mL的IPP。同時從培養(yǎng)第3天開始每隔3 d加入IL-2使之最終質量分數(shù)為500 U/mL。分配PBMCs在24孔板中，每孔細胞密度為1×106個細胞。培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2飽和濕環(huán)境中培養(yǎng)箱中。

1.3流式測定細胞數(shù)目培養(yǎng)第0 天，和第6～20天，每隔2～4 d收集1孔。PBMCs表面染色anti- human CD3(PB-BD)，anti-human TCR Vδ2 (PE-BD)。使用Gallios (Beckman Coulter) 流式細胞儀器測定，并用FlowJo (version 7.6.5，Tree Star)流式分析軟件分析。

1.4統(tǒng)計學分析對于臍帶血γδT細胞和成人外周血γδT細胞擴增的組間比較使用t檢驗，對于不同時間點擴增倍率比較采用重復測量的t檢驗。

2結果

2.1γδT 細胞擴增比率的測定結果詳見表1。

經過IPP加IL-2的擴增后，選取最高擴增比率得到結論：成人組為73.05%±2.92%，臍帶血組為38.66%±5.14%，二者比較有顯著性差異(P<0.05)。

表1　擴增率比較

2.2γδT 細胞不同時間點增殖倍數(shù)測定IPP加IL-2擴增γδT 細胞后，從第6天開始到第20天，每2～4 d檢測增殖倍數(shù)。臍帶血來源的γδT 細胞增殖倍數(shù)的高峰在第18天，而成人外周血來源的γδT 細胞增殖倍數(shù)高峰在第14天

3討論

圍生期的死亡因素中，嚴重的感染一直居高不下。近年來國內外的研究主要集中于新生兒適應性免疫應答和抗原提成細胞的成熟度，少有關于天然免疫反應能力的報道。新生兒時期免疫系統(tǒng)并未完全發(fā)育成熟，其功能與兒童及成人有較大差別。在生后初期，由于T細胞和B細胞的功能較多依賴于時間和抗原的刺激，因此適應性免疫應答在圍生期的發(fā)揮抗感染能力非常有限[4]。因此天然免疫在新生兒生后早期有至關重要的作用。

γδT細胞作為新近研究的天然免疫細胞，主要分布于外周血和淋巴器官中，主要的人類的γδT細胞以Vγ9Vδ2T細胞為主。Vγ9Vδ2T細胞是不受MHC分子限制作用的，通過isoprenoid biosynthesis 通路代謝。IPP可以通過macalonate 通路選擇性地活化γδT細胞。

但是國內外針對外周血的研究報道，γδT細胞在外周血PBMC中的比例2%～12%不等，我們選取的正常成人所測的比例在2.35%～6.84%之間，符合目前文獻報道。而我們的實驗結果發(fā)現(xiàn)，臍帶血中的γδT細胞在1.25%～2.15%之間，與之前的報道類似。如何有效地提高γδT細胞數(shù)目，目前國內外主要有IPP方法擴增，但是尚無人比較2種人類主要來源的γδT細胞的增殖效果以及增殖反應的最佳時間。我們的結果提示，以IL-2作為淋巴細胞生長的維持因子，有一定的輔助增殖作用；沒有IL2的擴增條件下，即使有高效的刺激因子，γδT細胞擴增仍然不明顯。進一步的試驗證實，擴增刺激劑在IL-2的輔助作用下，在不同的來源γδT細胞體系中有不同的擴增效率，成人γδT細胞對于IPP抗原刺激的反應明顯高于臍帶血來源的γδT細胞。

時間梯度擴增試驗發(fā)現(xiàn)，對于成人γδT細胞第14天的擴增時間最佳，但是對于臍帶血γδT細胞而言第18天的擴增效果最佳。試驗推測，因為IPP是直接作用的macalonate通路選擇性的活化γδT細胞，而臍帶血的γδT細胞的TCR受體的發(fā)育并不完善，并且數(shù)量較少，因此即使相同質量分數(shù)的IPP依然無法高效地引起增殖反應。

無論是臍帶血來源的γδT細胞還是成人外周血γδT細胞，在IPP加IL-2的輔助下經過適當?shù)呐囵B(yǎng)刺激時候之后，均能有效地進行擴增，但是臍帶血的擴增效能較低。我們的試驗結論為新生兒在遭遇急性感染時候，早期及時地擴增γδT細胞，提供高效的天然免疫能力， 及時啟動適應性免疫應答提供新的方法思路。

參考文獻：

[1]何振娟，陳同辛，吳圣楣，等．PMA和IM誘導的新生兒臍帶血淋巴細胞增殖反應[J]．新生兒科雜志，2000，15(4)：152-154, 191-192．

[2]郝麗，鄭成中．新生兒感染T淋巴細胞亞群及細胞因子變化分析[J]．臨床兒科雜志，2014，32(9)：825-828．

[3]胡朝英，錢柳，程偉志，等．γδ T細胞誘導與分化的初步研究-Ⅰ[J]．中國免疫學雜志，2010，26(4)：368-371．

[4]劉敬．臍血免疫功能研究進展[J]．中華圍產醫(yī)學雜志，2001(4)：65-66．

(收稿日期：2015-10-21)

[中圖分類號]R722

[文獻標識碼]A

DOI:10.11851/j.issn.1673-1557.2016.02.016

通信作者：任樹華，2359751116@qq.com

優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20151228.1653.016.html