重組腺病毒Ad-HP對胃癌的抑制作用

趙　津　李　奚　李一權　周　曄　陳　爽　蘭　添　范園園　李　霄　孫麗麗　金寧一

(長春工業大學化學與生命科學學院，長春130012)

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重組腺病毒Ad-HP對胃癌的抑制作用

趙津李奚李一權①周曄①陳爽①蘭添①范園園①李霄①孫麗麗②金寧一①

(長春工業大學化學與生命科學學院，長春130012)

[摘要]目的：探討表達HN蛋白的重組腺病毒Ad-HP在體內外對人胃癌細胞的抑制作用。方法：通過MTS法檢測Ad-HP(Ad-HN-PEG3p-E1a)對SGC7901細胞的增殖抑制效果，采用Annexin V染色、Caspase酶活性檢測、Western blot免疫印跡檢測揭示Ad-HP對SGC7901細胞的抑制方式和途徑。對BALB/c裸鼠進行瘤內注射Ad-HP探究其在體內的抗腫瘤作用。結果：體外實驗中Ad-HP明顯抑制SGC7901細胞增殖，并表現出時間效應和劑量效應關系。Ad-HP能提高Caspase酶活性，并釋放細胞色素C。體內實驗中Ad-HP能顯著延緩瘤體生長并延長模型動物的平均生存期，而且能上調IL-2和IFN-γ等細胞因子，使免疫反應朝向Th1優勢。結論：Ad-HP可特異性有效抑制胃癌細胞增殖和腫瘤生長。

[關鍵詞]人胃癌細胞； 溶瘤腺病毒；新城疫；PEG-3

全球范圍內，胃癌現位居發病率第4位和死亡率第2位[1]。現階段是通過外科手術、化學療法和放射療法聯用治療胃癌的[2]。但預后效果較差，早期胃癌患者術后5年生存率僅有25%～35%，晚期患者的平均存活期只有10～14個月[3-6]。傳統療法治療腫瘤是非特異性的，并伴有嚴重的毒副作用,這使我們急需研發一種針對腫瘤細胞的藥物來治療癌癥[7]。而溶瘤病毒是一種非病原病毒，能選擇性感染和殺傷腫瘤細胞，同時不損傷正常細胞，它的出現為腫瘤治療帶來了新希望[8]。

基于新城疫病毒(NDV)的抗癌性、腫瘤特異性、高效性及安全性，使其成為極具潛質的治療藥物。NDV是以單鏈反式RNA包膜的副粘病毒，能表達兩種表面蛋白：血凝素-神經氨酸酶(HN)和融合蛋白(F)。HN蛋白既能將病毒吸附在富含唾液酸的宿主細胞受體表面，也能從細胞中釋放病毒。而且HN蛋白在病毒感染時能誘導免疫保護，因而易受抗體免疫選擇壓作用影響產生抗原變異。此外，HN能在人外周血細胞中誘導產生IFN-α和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)，進而激活細胞凋亡途徑，因此HN能用于抗腫瘤治療[9，10]。

編碼鼠蛋白基因的最小啟動子區PEG-3是腫瘤特異性啟動子，能表達下游基因，已在大腦、前類腺、乳腺、胰腺和黑色素瘤等腫瘤組織中得到證實。PEG-3的特異性需轉錄因子AP-1和PEA-3共同調節[11，12]。

本課題目的在于研究表達HN蛋白的重組腺病毒對人胃癌細胞SGC7901的抑制作用。實驗中利用MTS檢測研究Ad-HP對SGC7901的體外抑制作用；通過Annexin V染色、caspase酶活性檢測和Western blot來判斷探討其抑制方式和途徑；最終經動物模型檢測Ad-HP對人胃癌細胞的體內抑制作用。

1材料與方法

1.1細胞和病毒人胃癌細胞SGC7901由本室保存，重組腺病毒Ad-HP(Ad-HN-PEG3p-E1a)、Ad-HN(Ad-HN)、Ad-GP(Ad-EGFP-PEG3p-E1a)和Ad-EGFP(Ad-EGFP)均由本室構建并鑒定。

1.2主要試劑MTS購自Sigma公司，Annexin V 細胞凋亡檢測試劑盒、caspase檢測試劑盒為碧云天生物研究所產品，FBS、RPMI1640培養液購自HyClone公司，ECL 試劑盒購自Pierce 公司，抗Cytochrome C抗體、抗GAPDH 抗體、抗PARP 抗體、抗La min A 抗體、抗鼠IgG 和抗兔IgG為Cell signaling 公司產品，6～8周齡雌性BALB/c裸鼠購自軍事醫學科學院實驗動物中心。

1.3MTS法檢測將SGC7901細胞按5×103個/孔接種于96孔板，以不同用量(1、10、100 moi)的 Ad-HP、Ad-GP、Ad-HN和Ad-EGFP分別感染細胞，分別培養24、48、72、96 h后，加20 μl/孔MTS/PMS混合液，于37℃、5%CO2孵育1～4 h，酶標儀檢測490 nm處吸收值D。細胞增殖抑制率=(對照組D值-實驗組D值)/對照組D值×100%。

1.4Annexin V染色將SGC7901細胞按1×106個/孔接種于6孔板，以100 moi劑量的Ad-HP、Ad-HN、Ad-EGFP和Ad-GP分別感染細胞，48 h后收集細胞，用195 μl binding-buffer重懸細胞后加5 μl Annexin V-FITC，避光作用10 min，離心，再重懸細胞于190 μl binding-buffer后加10 μl PI，混勻后用熒光顯微鏡觀察。

1.5caspase酶活性檢測將SGC7901細胞按1×105個/孔接種于6孔板，以100 moi劑量的Ad-HP、Ad-HN、Ad-EGFP和Ad-GP分別感染細胞，培養48 h收集細胞，加500 μl裂解液，置冰上15 min，離心15 min(4℃、12 000 r/min)，加Ac-DEVD-pNA、Ac-VEID-pNA和 Ac-YVAD-pNA反應底物，作用1～2 h，酶標儀于405 nm檢測caspase酶活性。

1.6Western blot細胞接種和病毒感染同1.3，48 h后收集細胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后定量蛋白，于10%SDS-PAGE電泳后分離，轉NC膜，5%脫脂乳封閉1 h，TBST洗膜，加入稀釋后一抗，反應1.5 h，洗膜3次后加入二抗(抗兔或抗鼠的IgG)，再洗膜后加ECL顯色劑，于暗房中顯影、定影后進行分析。

1.7動物實驗于小鼠右后肢皮下注射SGC7901細胞懸液0.1 ml(1×106個細胞)，每3d測量瘤體長徑(L)和短徑(W)，計算體積V=0.52×LW2，待長到米粒大小，隨機分5組( 10只/組)，A-E組相應為生理鹽水對照組、Ad-HP組、Ad-HN組、Ad-GP組及Ad-EGFP組，注射劑量1×108PFU/只/次/100 μl，每周1次，共4次；并每日觀察5組小鼠存活狀態，采集小鼠外周血，分離血清，按試劑盒說明檢測IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ細胞因子水平。

2結果

2.1Ad-HP對胃癌SGC7901細胞的抑制作用如圖1所示，同Ad-EGFP相比，Ad-HP、Ad-GP、Ad-HN均對SGC7901細胞有抑制作用，且大部分試驗點Ad-HP和Ad-GP抑瘤作用更強。感染劑量為1和10 moi時，48 h后Ad-HP、Ad-GP、Ad-HN才對SGC7901細胞有明顯抑制作用(P<0.05)；感染劑量為100 moi時的抑瘤效果均優于1和10 moi，72 h時Ad-HN的抑制率達到峰值(30.6±5.6)%后又下降，Ad-HP和Ad-GP在96 h抑制率分別可達到(41.6±2.3)%和(39.7±1.1)%。

2.2細胞凋亡檢測結果如圖2所示，經Annexin V/PI染色后，觀察到Ad-HP和Ad-HN感染后，有部分細胞經PI染色呈紅色，說明細胞開始凋亡，且Ad-HP 感染導致的細胞凋亡數更多。Ad-HP的早期及晚期凋亡分別占總細胞數8.53%和 8.98%，Ad-HN的早期及晚期凋亡分別占總細胞數 5.31%和 5.51%。

圖1　Ad-HP對SGC7901細胞的抑制作用Fig.1　Inhibitory effects of Ad-HP on SGC7901 cells

2.3caspase酶活性檢測結果如圖3所示，在Ad-EGFP、Ad-HP、Ad-HN分別感染SGC7901細胞48 h后，caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性均不同程度高于對照組，Ad-HP和Ad-HN尤為明顯，表明Ad-HP和Ad-HN具有顯著上調caspase-3、caspase-8和caspase-9酶的作用(P<0.05)，但兩者間無明顯差異(P>0.05)。

2.4Western blot檢測結果如圖4所示，在Ad-EGFP、Ad-HP、Ad-HN分別感染SGC7901細胞48 h后，Ad-HP和Ad-HN組產生了同Cytochrome C抗體結合的特異性條帶，而對照組和Ad-EGFP組中均未檢測到該條帶。

2.5模型動物腫瘤生長趨勢及生存期分析如圖5所示，SGC7901細胞小鼠移植瘤經重組腺病毒治療后，2.5周后Ad-GP、Ad-HN、Ad-HP治療組瘤體體積明顯比生理鹽水組和Ad-EGFP小，并且瘤體生長趨勢明顯減緩，表明具有一定的抑瘤效果。如圖6所示，生理鹽水組、Ad-EGFP和Ad-HN三組的平均生存期分別僅為13、12.8和14.4 d；與之相比，Ad-GP和Ad-HP治療組的平均生存期明顯延長，可分別達至20和20.4 d。

圖2　Ad-HP感染對SGC7901細胞凋亡的影響Fig.2　Effect of Ad-HP on apoptosis of SGC7901

圖3　SGC7901細胞中caspase酶活性檢測結果Fig.3　Analysis of caspase in SGC7901

2.6細胞因子水平檢測同空白對照組和生理鹽水對照組相比，Ad-HN和Ad-HP治療組在IL-2和IFN-γ的含量明顯高于Ad-GP和Ad-EGFP組，但兩者間無顯著差異(P>0.05)。但對照組和治療組中IL-4和IL-10的含量各組間并無明顯差異(P>0.05)。

圖4　Ad-HP感染對SGC7901細胞中Cytochrome C釋放的影響Fig.4　Effect of Ad-HP on Cytochrome C in SGC7901 cellsNote: 1.Control;2.Ad-EGFP;3.Ad-HP;4.Ad-HN.

圖5　小鼠腫瘤生長趨勢圖Fig.5　Tumor growth kinetics of mice

圖6　Ad-HP延長小鼠平均生存期Fig.6　Ad-HP extended average survival times of mice

圖7　小鼠細胞因子含量(pg/ml)Fig.7　Cytokine content in mice(pg/ml)

3討論

目前基因治療已發展成熟，攜帶抗癌基因的溶瘤病毒已成為腫瘤病毒療法的關注焦點，利用具備抑瘤基因、促細胞凋亡基因、抗血管生成基因、自殺性基因、RNA干擾基因和免疫調節等功能基因進行治療[13]?；谌芰鱿俨《灸軓V泛應用，有多種抑瘤機制，包括細胞溶解、誘發凋亡、毒蛋白表達、自噬、終止蛋白合成等都能引發抗腫瘤免疫，因此使其成為腫瘤治療中的有效手段[13,14]。20世紀末，NDV作為一個熱點研究領域出現，不僅源于其經濟價值更關注其溶瘤潛能，并且對人無致病性，無毒副作用，使用相對安全。NDV能有效誘導合成像IFN和腫瘤壞死因子等細胞因子，通過應用重組NDV表達如IL-2和TNF-α免疫刺激因子來增強NDV溶瘤特性。因此利用NDV重組腺病毒進行抗腫瘤治療是一種醫療趨勢。

本研究評價了Ad-HP、Ad-GP、Ad-HN及Ad-EGFP四種重組腺病毒對人胃癌細胞SGC7901的體內外抑制作用。結果表明，Ad-HP和Ad-GP對SGC7901細胞生長和增殖的抑制作用明顯強于另兩組。當延長感染時間和增加感染劑量時，抑制效果顯著增強，表現出一定的劑量效應和時間效應關系。Ad-HP和Ad-GP中都插入了PEG-3基因，表明PEG-3能限制腫瘤細胞生長增殖。目前已有多個課題組報道了PEG-3在治療乳腺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤方面的應用，證實了PEG-3是腫瘤特異性啟動子，能參與靶向性基因治療[11，12]。

凋亡是細胞程序性死亡，能除去有害及嚴重受損的細胞，并維持多細胞生物內的組織穩態。目前很多病毒都能誘發感染細胞的凋亡和病變效應。幾項研究表明，NDV能在感染細胞內激活內源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑，最終誘導caspase依賴途徑引發細胞凋亡，使細胞發生生化性質和形態學改變[15，16]。線粒體釋放出細胞色素C，在dATP存在時與凋亡相關因子1(Apaf-1)結合形成多聚體，促使caspase-9與其結合形成凋亡小體激活caspase-9，caspase-9再激活其他caspase如caspase-3等，從而誘導細胞凋亡。本實驗中Ad-HP和Ad-HN組Western blot檢測到細胞色素C的釋放，同時caspase酶活性檢測到caspase-3、8、9酶活性都有明顯提升，驗證了Ad-HP和Ad-HN是通過激活caspase相關酶來誘導細胞凋亡，實現對人胃癌細胞SGC7901的抑制作用的。

小鼠瘤內注射重組腺病毒結果表明，Ad-HP和Ad-GP治療組瘤體生長速度明顯減慢，平均生存期顯著延長。同時Ad-HP和Ad-HN能上調IL-2和IFN-γ等細胞因子水平，表明其能活化NK細胞，刺激免疫活性，顯示重組腺病毒Ad-HP是在抑制腫瘤細胞增殖同時刺激其發揮免疫作用來進行基因治療腫瘤的。

綜上所述，Ad-HP重組腺病毒能通過誘導人胃癌細胞凋亡進而抑制腫瘤生長，其對用基因治療腫瘤提供理論基礎，并具有潛在的臨床應用價值。

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[收稿2015-09-30修回2015-10-20]

(編輯許四平)

Anti-tumor effects of recombinant adenovirus Ad-HP on gastric cancer

ZHAOJin,LIXi,LIYi-Quan,ZHOUYe,CHENShuang,LANTian,FANYuan-Yuan,LIXiao,JINNing-Yi.

SchoolofChemistryandLifeScience,ChangchunUniversityofTechnology,Changchun130012,China

[Abstract]Objective:To investigate the anti-tumor effects of a recombinant adenovirus Ad-HP that express HN protein on human gastric cancer cell proliferation in vitro and in vivo.Methods: In vitro,infection with Ad-HP could inhibit the proliferation of SGC7901,cell viability was assessed by MTS assay，Annexin V assay，Caspase assay and Western blot were used to reveal the suppression apoptosis method and pathway of Ad-HP on SGC7901 cells.In vivo,BALB/c nude mice were treated via intratumoral injection of Ad-HP to investigate the anti-tumor effects.Results: In vitro,Ad-HP significantly suppressed SGC7901 proliferation,and depended on the treat time and treat dose.The infection of Ad-HP resulted in the upregulation of caspase enzymes ,and release of Cytochrome C.In vivo,Ad-HP could significantly delay tumor growth and prolong the mean survival of model animals;Ad-HP upregulated the cytokines such as IL-2 and IFN-γ prompt immune reaction to Th1.Conclusion: The oncolytic adenovirus Ad-HP could inhibit proliferation of gastric cancer cells and growth of tumors.

[Key words]Human gastric carcinoma cell;Oncolytic adenovirus;NDV;PEG-3

中圖分類號R373.2+1

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0362-05

作者簡介：趙津(1986-)，女，碩士，主要從事分子病毒學研究。通訊作者及指導教師：金寧一(1956-)，男，研究員，博士生導師，主要從事分子病毒學研究，E-mail: ningyik@126.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.015

①軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，長春130122。

②吉林省腫瘤醫院頭頸外科，長春130012。