硫化氫通過抑制壞死性凋亡對抗高糖引起的H9c2心肌細胞損傷*

梁偉杰，　何潔儀，　張穩(wěn)柱，　余盛龍，　陳　君，　宋明才，　陳景福，　鄭東誕，　廖新學

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科， 2廣州市番禺區(qū)心血管疾病研究所，廣東 廣州 511400； 3中山大學附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)心血管內(nèi)科CCU，廣東 廣州 510700； 4中山大學附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

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硫化氫通過抑制壞死性凋亡對抗高糖引起的H9c2心肌細胞損傷*

梁偉杰1,2，何潔儀1,2，張穩(wěn)柱1,2，余盛龍1,2，陳君1, 2，宋明才1,2，陳景福3，鄭東誕3，廖新學4△

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，2廣州市番禺區(qū)心血管疾病研究所，廣東 廣州 511400；3中山大學附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)心血管內(nèi)科CCU，廣東 廣州 510700；4中山大學附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

[摘要]目的： 探討硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)能否通過調(diào)控壞死性凋亡(necroptosis)對抗高糖(HG)引起的H9c2 心肌細胞損傷。方法：應(yīng)用Western blot法檢測心肌細胞內(nèi)能反映壞死性凋亡的RIP3蛋白和cleaved caspase-3蛋白的水平；細胞計數(shù)盒測定心肌細胞存活率；雙氯熒光素染色熒光顯微鏡照相法檢測細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平；羅丹明 123染色熒光顯微鏡照相法測定線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)；Hoechst 33258核染色熒光顯微鏡照相法測定凋亡細胞的數(shù)量。結(jié)果：應(yīng)用HG (35 mmol/L葡萄糖)處理H9c2 心肌細胞3 h、6 h、9 h、12 h和24 h均能明顯地上調(diào)RIP3蛋白的表達水平，其中24 h時RIP3蛋白水平增加最明顯。400 μmol/L硫氫化鈉(NaHS;為H2S的供體)預(yù)處理或壞死性凋亡的特異性阻斷劑necrostatin-1(Nec-1;100 μmol/L)共處理心肌細胞均能明顯地抑制HG對RIP3蛋白表達的上調(diào)作用。此外，NaHS預(yù)處理或Nec-1共處理心肌細胞均顯著地抑制HG引起的心肌細胞損傷，使細胞存活率升高，ROS生成及MMP丟失減少。另一方面，400 μmol/L NaHS預(yù)處理心肌細胞能使凋亡細胞數(shù)量及cleaved caspase-3表達明顯減少。結(jié)論：H2S可通過抑制壞死性凋亡保護心肌細胞,對抗高糖引起的損傷。

[關(guān)鍵詞]壞死性凋亡； 硫化氫； 高糖； 心肌細胞

細胞是機體基本結(jié)構(gòu)和功能單位。細胞死亡是生命的基本過程，對多細胞生物的發(fā)育和自穩(wěn)平衡極其重要。細胞死亡可分為凋亡(apoptosis)、壞死(necrosis)、自噬(autophagy)和壞死性凋亡(necroptosis)[1-2]。細胞凋亡是主動的程序性死亡方式，細胞壞死一直被認為是一種隨機且不受基因調(diào)控的細胞死亡方式。而壞死性凋亡是一種非凋亡性的程序性死亡方式，即細胞既具有壞死的形態(tài)學改變，又具有凋亡所具備的規(guī)律性調(diào)控機制[3]。壞死性凋亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡方式，參與缺血性心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和肝、腎臟器損害等多種疾病的發(fā)生[3-6]，深入研究壞死性凋亡的發(fā)生機制有助于更好地理解體內(nèi)許多病理生理過程并尋找疾病治療的新靶點。在壞死性凋亡的發(fā)生發(fā)展過程中，受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein，RIP)發(fā)揮極其重要的調(diào)控作用，是反映壞死性凋亡的重要指標。目前，RIP蛋白家族由RIP1～RIP7共7個成員組成，其中RIP1和RIP3是參與壞死性凋亡的關(guān)鍵分子蛋白，其相互作用是啟動壞死性凋亡的關(guān)鍵。RIP3的表達與壞死性凋亡呈正相關(guān)，下調(diào)RIP3后可以阻止細胞發(fā)生壞死性凋亡[3-4,6]。有研究指出，在鏈脲霉素(streptozotocin,STZ)誘導的糖尿病大鼠，心肌炎癥、纖維化及肥厚的發(fā)生伴隨著RIP3的大量表達[7]，提示壞死性凋亡可能參與高血糖引起的心肌損傷，但該研究小組沒有觀察抑制壞死性凋亡活動后能否對抗高血糖引起的心肌損傷作用。因此，進一步證實這個問題，對防治糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生有重要的意義。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼NO和CO之后第3種內(nèi)源性氣體信號分子[8]。近年來，H2S在心血管系統(tǒng)的保護作用備受關(guān)注。我們已證實外源性H2S能保護H9c2 心肌細胞對抗高糖引起的心肌細胞毒性、氧化應(yīng)激、線粒體損傷、炎癥及致凋亡作用等一系列的損傷[9-12]。根據(jù)既往的研究[7]，我們推測壞死性凋亡可能參與高血糖引起的心肌細胞損傷，但是，H2S能否通過對抗高糖引起的壞死性凋亡從而發(fā)揮其心肌保護作用，目前國內(nèi)外尚未見報道。

為此，本研究建立高糖損傷H9c2心肌細胞模型[9]，旨在探討壞死性凋亡在高糖引起心肌細胞損傷中的作用及外源性H2S能否通過抑制壞死性凋亡對抗高糖引起的心肌細胞損傷。

材料和方法

1材料

抗RIP3抗體購自CST；necrostatin-1(Nec-1)、抗cleaved caspase-3抗體、硫氫化鈉(NaHS)、雙氯熒光素(2’， 7’-dichlorfluorescein diacetate，DCFH-DA)、Hoechst 33258和羅丹明123(rhodamine 123，Rh 123)購自Sigma；細胞計數(shù)試劑盒8(Cell Counting Kit-8, CCK-8)由Dojindo供應(yīng)；DMEM培養(yǎng)基購自HyClone；特級胎牛血清購自Gibco。H9c2 心肌細胞由中山大學實驗動物中心提供。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)H9c2 心肌細胞來源于大鼠胚胎期的心臟組織，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2實驗分組實驗分為6組：(1)正常對照(control)組：DMEM培養(yǎng)基(5.5 mmol/L 葡萄糖)處理心肌細胞24 h；(2)高糖(high glucose，HG)損傷組：35 mmol/L 葡萄糖處理心肌細胞24 h；(3)NaHS+HG組：400 μmol/L NaHS作用心肌細胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著用35 mmol/L葡萄糖處理24 h；(4)Nec-1+HG組：100 μmol/L Nec-1與35 mmol/L葡萄糖共處理心肌細胞24 h；(5)NaHS組：400 μmol/L NaHS作用心肌細胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著DMEM培養(yǎng)基處理24 h；(6)Nec-1組：100 μmol/L Nec-1 與DMEM培養(yǎng)基共處理心肌細胞24 h。

2.3Western blot法檢測RIP3和cleaved caspase-3的蛋白水平將H9c2 心肌細胞接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至80%時，各實驗組給予不同的處理因素后，用預(yù)冷的PBS沖洗3次，加入裂解液，4 ℃靜置30 min，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，采用BCA法進行蛋白定量。總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉60 min，隨后加入抗RIP3抗體或抗cleaved caspase-3抗體(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜，然后用TBST洗3次，每次5 min，與相應(yīng)的 II 抗(1∶2 500)在室溫孵育1.5 h，用TBST洗3次，5 min/次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。實驗重復5次。

2.4CCK-8測定細胞存活率將H9c2 心肌細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，當心肌細胞生長到占培養(yǎng)孔面積大約80%時，按各分組處理后，于每孔中加入10 μL CCK-8和90 μL DMEM，輕搖，37 ℃孵育2.5 h，用酶標儀(λ=450 nm)記錄各孔吸光度(A)。取5孔A值的平均數(shù)，按下列公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)=處理組A值/對照組A值×100%。實驗重復5次。

2.5DCFH-DA染色測定胞內(nèi)ROS水平將H9c2 心肌細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，當細胞生長到培養(yǎng)孔面積大約80%時，經(jīng)上述各實驗組不同的處理因素作用后，PBS沖洗3次，用10 μmol/L DCFH-DA染液于37 ℃溫箱中孵育30 min，然后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡(TE-2000 Nikon)下隨機選取5個不重復區(qū)攝片，用ImageJ 1.47i軟件分析5個視野綠色熒光強度的平均值[平均熒光強度(mean fluorescent intensity，MFI)，間接反映ROS水平的指標]，再對每組的各樣本進行統(tǒng)計分析。實驗重復5次。

2.6Rh 123染色測定線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)將H9c2 心肌細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，當細胞生長到培養(yǎng)孔面積大約80%時，上述各實驗組經(jīng)不同的處理因素作用后，用PBS沖洗3次，用10 μg/L Rh 123的無血清培養(yǎng)基于37 ℃溫箱中孵育45 min，然后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復區(qū)攝片，細胞核周圍綠色的亮點即為攝取了Rh 123的線粒體。用ImageJ 1.47i軟件分析5個視野綠色熒光的MFI(數(shù)值大小可間接反映MMP水平)，再對每組的各樣本進行統(tǒng)計分析。實驗重復5次。

2.7Hoechst 33258核染色檢測細胞凋亡將H9c2心肌細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，在細胞生長到占培養(yǎng)孔面積大約80%時，按各分組處理后，用PBS沖洗3次，然后用4%多聚甲醛于4 ℃環(huán)境中固定10 min，加入含5 mg/L Hoechst 33258試劑，于37 ℃溫箱孵育30 min，在熒光顯微鏡(TE-2000 Nikon)下攝片，鑒別正常的心肌細胞和凋亡的心肌細胞，隨機選取視野在熒光顯微鏡下攝片。實驗重復5次。

3統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用 SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有結(jié)果以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，用SNK-q檢驗進行均數(shù)之間的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1Nec-1抑制HG對心肌細胞RIP3蛋白表達的上調(diào)作用

高糖分別處理H9c2 心肌細胞0～24 h，其中，3 h時RIP3蛋白的表達水平開始明顯升高(P<0.01)，6 h、9 h、12 h時進一步升高(P<0.01)，HG作用24 h時，RIP3蛋白表達水平最高(P<0.01)。應(yīng)用100 μmol/L壞死性凋亡的特異性阻斷劑Nec-1與HG共處理心肌細胞24 h，能明顯抑制HG對RIP3的上調(diào)作用，與HG損傷組比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。100 μmol/L Nec-1本身對心肌細胞RIP3蛋白的基礎(chǔ)表達水平無明顯影響，見圖1。

Figure 1.Necrostatin-1 (Nec-1; an inhibitor of necroptosis) attenuated high glucose (HG; 35 mmol/L glucose)-induced up-regulation of RIP3 expression in the H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖1Nec-1抑制高糖對H9c2 心肌細胞RIP3表達的上調(diào)作用

2H2S減弱高糖對心肌細胞RIP3蛋白表達的上調(diào)作用

HG處理心肌細胞24 h可使RIP3蛋白的表達明顯增多，但是，在HG處理心肌細胞前，應(yīng)用400 μmol/L NaHS預(yù)處理30 min可使HG對RIP3蛋白表達的上調(diào)作用顯著減弱，與HG處理組比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。400 μmol/L NaHS本身對心肌細胞RIP3蛋白的基礎(chǔ)表達水平無明顯的影響,見圖2。

Figure 2.Hydrogen sulfide (H2S) attenuated HG-induced up-regulation of RIP3 expression in the H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖2H2S減弱高糖對心肌細胞RIP3表達的上調(diào)作用

3H2S和Nec-1抑制高糖引起的心肌細胞毒性

高糖處理H9c2 心肌細胞24 h，可誘導明顯的細胞毒性，使細胞存活率明顯降低，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。但是，應(yīng)用400 μmol/L NaHS預(yù)處理心肌細胞30 min能明顯地抑制HG引起的心肌毒性，使細胞存活率升高，與HG組處理組比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。400 μmol/L NaHS本身不影響心肌細胞的存活率。

與NaHS的作用相類似，應(yīng)用100 μmol/L Nec-1共處理心肌細胞24 h也能對抗HG對細胞存活率的抑制作用(P<0.01)。單純予100 μmol/L Nec-1共處理心肌細胞對細胞存活率無明顯的影響,見圖3。

4H2S和Nec-1抑制高糖引起的心肌細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)

高糖作用心肌細胞可引起明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為MFI明顯增強，與正常對照(control)組比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。但是，HG+NaHS組顯示400 μmol/L NaHS預(yù)處理心肌細胞30 min能使胞內(nèi)ROS生成明顯地減少，MFI從(30.60±1.25)%減少至(14.00±1.06)%，與HG組比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。與NaHS的作用相類似，應(yīng)用100 μmol/L Nec-1共處理心肌細胞24 h也能使細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕，MFI減少至(13.60±1.38)%。分別應(yīng)用400 μmol/L NaHS或100 μmol/L Nec-1處理心肌細胞對ROS的基礎(chǔ)生成無明顯的影響，見圖4。

Figure 3.Hydrogen sulfide (H2S) and necrostatin-1 (Nec-1) inhibited HG-induced cytotoxicity in the H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖3H2S和Nec-1抑制高糖引起的心肌細胞毒性

5H2S和Nec-1減少高糖引起的心肌細胞線粒體膜電位丟失

如圖5所示，采用HG作用H9c2心肌細胞24 h可使胞內(nèi)Rh 123的MFI從(30.50±1.27)%降低至(9.57±0.90)%，2組差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。然而，400 μmol/L NaHS預(yù)處理心肌細胞30 min能顯著地減少MMP的丟失，使MFI升高至(20.40±1.38)%，與HG處理組比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。與NaHS的作用相類似，應(yīng)用100 μmol/L Nec-1共處理心肌細胞24 h也能對抗HG對心肌細胞線粒體的損傷，使MFI增加至(20.50±1.20)%。分別應(yīng)用400 μmol/L NaHS或100 μmol/L Nec-1處理心肌細胞對細胞MMP的大小無顯著影響。

6H2S抑制高糖的致心肌細胞凋亡作用

Hoechst核染色的檢測結(jié)果顯示，正常H9c2心肌細胞的染色質(zhì)分布均勻，呈現(xiàn)出彌散均勻的低密度熒光。應(yīng)用HG處理心肌細胞24 h后，呈現(xiàn)典型的凋亡特征(即細胞核呈現(xiàn)濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒熒光)的細胞數(shù)量增多，與正常對照組比較，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。應(yīng)用400 μmol/L NaHS預(yù)處理心肌細胞30 min能明顯地減少凋亡細胞數(shù)量，與HG處理組比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。

Figure 4.Hydrogen sulfide (H2S) and necrostatin-1 (Nec-1) inhibited HG-induced accumulation of intracellular reactive oxygen species (ROS) in the H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖4H2S和Nec-1抑制高糖引起的心肌細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)

Figure 5.Hydrogen sulfide (H2S) and necrostatin-1 (Nec-1) inhibited HG-induced loss of mitochondrial membrane potential (MMP) in the H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖5H2S和Nec-1抑制高糖引起的心肌細胞線粒體膜電位丟失

同樣地，HG處理心肌細胞24 h能明顯增加cleaved caspase-3(為凋亡的終末效應(yīng)器)的水平，應(yīng)用400 μmol/L NaHS預(yù)處理心肌細胞30 min能使cleaved caspase-3的蛋白水平明顯減少，與HG損傷組比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01),見圖6。

Figure 6.Hydrogen sulfide (H2S) reduced HG-induced apoptosis of H9c2 cells. A: Hoechst 33258 staining; B: cleaved caspase-3 protein expression detected by Western blot. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖6H2S抑制高糖的致心肌細胞凋亡作用

討論

壞死性凋亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡方式，既具有壞死的形態(tài)學特征，又具有凋亡所具備的程序性調(diào)控機制，其英文命名“necroptosis”就是由凋亡(aptoptosis)和壞死(necrosis)2個單詞組合而成。研究證實：壞死性凋亡參與缺血性心臟血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生[3-7]，是目前國際上極其活躍的研究熱點之一。研究表明，RIP1和RIP3是啟動壞死性凋亡的關(guān)鍵蛋白分子[3-4,6,13]。Luedde等[13]證實：心肌梗死的大鼠，其心肌細胞的RIP3蛋白表達明顯上調(diào)，而過量表達的RIR3可導致壞死性凋亡的發(fā)生。Liu等[7]報道：在鏈脲霉素誘導的糖尿病大鼠，心肌炎癥、纖維化、肥厚的發(fā)生伴隨著RIP3的大量表達，提示糖尿病大鼠的心肌存在壞死性凋亡。與他們的研究結(jié)果相類似，本研究觀察到HG在引起心肌細胞損傷的同時，可呈時間依賴性地上調(diào)心肌細胞RIP3蛋白的表達水平，并從細胞學水平進一步證實，HG可引起心肌細胞壞死性凋亡的發(fā)生。為了進一步證實壞死性凋亡在HG損傷心肌細胞中的作用，本研究觀察了壞死性凋亡的特異性抑制劑Nec-1對HG誘導的心肌細胞損傷的影響，結(jié)果表明，Nec-1在抑制RIP3蛋白表達上調(diào)的同時，還能減輕HG引起的心肌細胞多種損傷，使細胞存活率升高、ROS生成及MMP丟失減少。上述結(jié)果清晰地提示：壞死性凋亡介導HG導致的細胞毒性、氧化應(yīng)激和線粒體損傷等心肌損傷，這進一步擴展了Liu等[7]的研究結(jié)果，為闡明壞死性凋亡在糖尿病心肌損傷中的作用提供了新的實驗依據(jù)。

H2S是繼NO和CO之后的第3種內(nèi)源性氣體信號分子，具有多種生理和病理生理功能。最近，H2S在糖尿病相關(guān)的心血管系統(tǒng)并發(fā)癥中的防治作用得到了國內(nèi)外學者的極大關(guān)注。我們已證實H2S通過調(diào)控p38 絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、瘦素(leptin)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路和ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive K+channel, KATP通道)[9-12]，保護心肌細胞對抗高糖引起的一系列損傷，包括抗細胞毒性、抗氧化、減輕線粒體損傷、抗炎癥和抗凋亡等。但H2S的心肌細胞保護作用及機制是十分復雜的，可能涉及其它未知的作用和信號通路，因此，進一步深入探討H2S的心肌保護作用及機制非常有意義。本研究重點探討了H2S能否通過抑制壞死性凋亡對抗HG引起的心肌細胞損傷。我們首先觀察了H2S對HG促進RIP3表達作用的影響。結(jié)果表明，H2S能抑制HG對心肌細胞RIP3蛋白表達的上調(diào)作用。此外，應(yīng)用H2S預(yù)處理心肌細胞和應(yīng)用Nec-1共處理心肌細胞均產(chǎn)生類似的心肌保護作用，表現(xiàn)為細胞存活率升高、ROS 生成及MMP丟失減少。這些結(jié)果充分地證明：H2S是壞死性凋亡的抑制劑之一，抑制壞死性凋亡可能是H2S心肌細胞保護作用的另一個重要機制。值得注意的是，Han等[14]報道，應(yīng)用壞死性凋亡的抑制劑Nec-1可使紫草素誘導的腫瘤細胞(HL60細胞)壞死性凋亡轉(zhuǎn)化為凋亡，即加重細胞凋亡的發(fā)生。但是，本研究并沒有觀察到H2S在抑制壞死性凋亡的同時，增加心肌細胞凋亡發(fā)生的情況。同時能抑制壞死性凋亡和細胞凋亡(表現(xiàn)為凋亡細胞數(shù)量及cleaved caspase-3表達減少)，表明H2S是理想的心肌細胞保護劑。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Hydrogen sulfide protects H9c2 cardiomyocytes against high glucose-induced injury by inhibiting necroptosis

LIANG Wei-jie1,2, HE Jie-yi1,2, ZHANG Wen-zhu1,2, YU Sheng-long1,2, CHEN Jun1,2, SONG Ming-cai1,2, CHEN Jing-fu3, ZHENG Dong-dan3, LIAO Xin-xue4

(1DepartmentofCardiology,CentralHospitalofPanyuDistrict,2CardiovascularInstituteofPanyuDistrict,Guangzhou511400,China;3CardiacCareUnit,DepartmentofCardiology,HuangpuDivisionofTheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510700,China;4DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:liaoxinx@mail.sysu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To study whether hydrogen sulfide (H2S) protects H9c2 cardiomyocytes against high glucose (HG)-induced injury by inhibiting necroptosis. METHODS: The protein levels of RIP3 (an indicator of necroptosis) and cleaved caspase-3 were determined by Western blot. The cell viability was measured by CCK-8 assay. The intracellular le-vels of reactive oxygen species (ROS) were detected by 2’, 7’-dichlorfluorescein diacetate staining followed by photofluorography. Mitochondrial membrane potential (MMP) was examined by rhodamine 123 staining followed by photofluorography. The number of apoptotic cells was observed by Hoechst 33258 nuclear staining followed by photofluorography. RESULTS: After the H9c2 cells were treated with HG (35 mmol/L glucose) for 0～24 h, the protein expression of RIP3 in the H9c2 cells was significantly increased at 3 h, 6 h, 9 h, 12 h and 24 h, reaching the maximum level at 24 h. Pretreatment of the cells with 400 μmol/L NaHS (a donor of H2S) or co-treatment of the cells with necrostatin-1 (Nec-1; a speci-fic inhibitor of necroptosis) considerably blocked the up-regulation of RIP3 protein induced by HG. Moreover, pretreatment with NaHS or co-treatment with Nec-1 obviously inhibited HG-induced injuries, leading to an increase in the cell viability, and decreases in the generation of ROS and MMP loss. On the other hand, pretreatment with NaHS also reduced the number of apoptotic cells and the protein level of cleaved caspase-3 in the HG-treated H9c2 cardiomyocytes. CONCLUSION: H2S protects H9c2 cardiomyocytes against HG-induced injury by inhibiting necroptosis.

[KEY WORDS]Necroptosis; Hydrogen sulfide; High glucose; Cardiomyocytes

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.001

[中圖分類號]R363.2

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 020-87332628; E-mail： liaoxinx@mail.sysu.edu.cn

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81270296)；廣東省財政科技項目(No. 2014SC107)

[收稿日期]2015- 12- 24[修回日期] 2016- 01- 04

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0385- 07

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