IL-6和AG490對Burkitt淋巴瘤細胞生長的影響*

李品浩，　楊文秀，　陳　琴，　裴媛媛

(貴陽醫學院病理學教研室，貴州 貴陽 550004)

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IL-6和AG490對Burkitt淋巴瘤細胞生長的影響*

李品浩，楊文秀△，陳琴，裴媛媛

(貴陽醫學院病理學教研室，貴州 貴陽 550004)

[摘要]目的： 觀察IL-6和AG490對Raji細胞生長的影響，探討信號轉導及轉錄激活因子3(STAT3)及survivin在Burkitt淋巴瘤發生發展中的作用，為尋找淋巴瘤生物治療的新靶標提供實驗依據。方法: 培養Raji細胞，分別加入STAT3的激動劑IL-6和抑制劑AG490，用real-time PCR和Western blot檢測STAT3、survivin的表達情況及STAT3的磷酸化，MTT法檢查細胞活力，流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期變化。結果: 培養細胞中加入IL-6或AG490后，細胞生長受明顯影響并呈現藥物濃度依賴關系(P<0.05)；與相應的對照組比較， IL-6組Raji細胞中STAT3、survivin mRNA的表達明顯升高， AG490組Raij細胞中STAT3、survivin的mRNA表達明顯降低。不同濃度的IL-6組之間、不同濃度的AG490組之間，STAT3和survivin mRNA的表達亦有顯著差異(P<0.05)，且2種基因mRNA表達都呈現出藥物濃度依賴關系。p-STAT3、STAT3和survivin的蛋白水平在IL-6 作用下表達增高，AG490 作用下表達降低；細胞凋亡率在IL-6作用下逐漸降低，在AG490作用下逐漸升高，且都呈現出藥物濃度依賴關系；經AG490處理后，G1期Raji細胞明顯增加，S期細胞無明顯改變，G1/S比值增加，而在IL-6組中，S期細胞明顯降低。結論: IL-6和AG490對Raji細胞生長有明顯影響，STAT3及其下游靶基因survivin的表達改變可能是IL-6及AG490影響Raji細胞生長的重要分子機制。

[關鍵詞]Burkitt淋巴瘤細胞; 信號轉導及轉錄激活因子3； Survivin

信號轉導及轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是STATs家族的重要成員，其基因是一個重要的癌基因。在多種腫瘤細胞中均已發現有STAT3的持續性過度激活。臨床研究發現：肝癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌和前列腺癌等腫瘤中的 STAT3 活性均發生高頻率的異常活化，且其活化程度與患者的預后呈顯著負相關[1-6]。

由于 STAT3 是EGFR、IL-6/JAK、Src 等多個致癌性酪氨酸激酶信號通道的匯聚焦點[7]，阻斷 STAT3傳導通路便可以誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長。近年來，以 STAT3 為靶點的腫瘤治療研究逐漸被重視[8]。

在淋巴造血組織腫瘤中STAT3異常的研究主要集中在白血病這一非實體性的腫瘤，而在淋巴瘤這類實體性腫瘤中的研究較少見。Soldini等[9]報道，Burkitt淋巴瘤中發現STAT3的異常活化，然而其活化對Burkitt淋巴瘤影響的分子機制尚未完全清楚。本研究觀察了STAT3激動劑IL-6和抑制劑AG490對Raji細胞生長的影響，并進一步探討了其分子機制，為尋找臨床治療Burkitt淋巴瘤可能的基因靶點提供實驗依據。

材料和方法

1實驗材料

Burkitt細胞株Raji細胞購自中國科學院上海細胞庫。培養所用培養基RPMI-1640購自HyClone；總RNA提取試劑盒購自上海碧云天公司；real-time PCR試劑盒購自Invitrogen；抗STAT3、survivin和β-actin抗體購自Santa Cruz；抗p-STAT3 購自CST； AG490購自Sigma；IL-6購自 Pepro TECH。PCR引物由上海生工合成。

2方法

2.1細胞培養和實驗分組將Raji細胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養液中，并于37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養箱中培養，每2～3 d換液1次，待細胞計數大于1×109/L時，按 1∶2 ～1∶3傳代培養。收集細胞并調節濃度為2×108/L，根據加入藥物AG490(0、25、50、75、100 mg/L)和IL-6(0、50、100、150、200 μg/L)進行分組，分別于培養24 h、48 h、72 h后測定并統計。

2.2細胞活力的檢測細胞生長活力采用MTT法進行檢測。實驗時收集Raji細胞，于無血清培養基中培養24 h，同步化后96孔板布板，根據上述分組，分別于培養24 h、48 h、72 h后測定并統計，測定每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L，即0.5% MTT)，繼續培養4 h，每孔加入150 μL三聯溶劑(SDS 10 g， 異丁醇 5 mL， 10 mol/L HCl 0.1 mL,用雙蒸水溶解配成100 mL溶液)，置搖床上低速振蕩10 min，鏡下觀察結晶物充分溶解后在酶標儀490 nm處測量各孔的吸光度(A)。每組5個復孔，實驗重復3次。

2.3STAT3和survivin的mRNA檢測細胞總RNA由碧云天總RNA提取試劑盒提取，測定RNAA260/A280比值處于1.8～2.2之間，符合下續實驗要求。逆轉錄為cDNA后real-time PCR測定mRNA相對表達量。PCR循環參數：95 ℃ 10 min；9 ℃ 15 s ，60 ℃ 1 min，40個循環。結果用相對定量分析方法計算并以2-ΔΔCt表示。 用β-actin 作為內參照計算STAT3和survivin的mRNA相對表達量。PCR引物序列和產物見表1。

表1Real-time PCR引物序列及產物

Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR and corresponding products

NamePrimersequence(5'-3')Products(bp)STAT3CAGTCCGTGGAACCATACA-CAAAGC154CAATACTTTCCGAATGCCTCCTC-CTTSurvivinGCCAGATTTGAATCGCGGGA185GCAGTGGATGAAGCCAGCCTβ-actinTGGCACCCAGCACAATGAA186CTAAGTCATAGTCCGC-CTAGAAGCA

2.4Western blot測定STAT3、p-STAT3和survivin的蛋白水平由前面實驗數據得出細胞的藥物最佳處理濃度，AG490最佳濃度取50 mg/L，IL-6最佳濃度取100 μg/L。 收集足量該濃度下培養48 h 的細胞， PBS充分洗滌去除藥物及培養液后，加入適量的細胞裂解液及相應的蛋白酶抑制劑，于冰上充分裂解30 min，并不時振蕩，12 000 r/min離心5 min取上清，即為所得蛋白樣品。樣品溶液用BCA法進行定量，每孔上樣量為30 mg，然后進行SDS-PAGE，電泳后轉至PVDF膜， p-STAT3用5% BSA封閉，其它目的蛋白用5%脫脂牛奶封閉后，分別加 I 抗孵育過夜，STAT3 (1∶500稀釋)， p-STAT3 (1∶500稀釋)，survivin (1∶500稀釋)，β-actin (1∶1 000稀釋)，洗膜后，加辣根過氧化酶偶聯的II抗(1∶5 000稀釋)孵育1.5 h，再洗膜后加 ECL 發光液顯色，暗室曝光，得到STAT3、p-STAT3和survivin的條帶膠片。膠片掃描后用Gelpro32軟件分析。

2.5細胞周期和細胞凋亡的檢測培養細胞，根據加入藥物AG490(0、25、50、75 mg/L)和IL-6(50、100、150 μg/L)藥物濃度進行分組，分別于培養24 h、48 h、72 h后收集細胞。加入70%冰乙醇固定過夜，離心后棄上清，PBS 洗滌3遍，加入200 μL碘化丙啶 (propidium iodide，PI) 染色，37 ℃避光孵育15 min，過濾后用流式細胞儀檢測細胞周期各期分布。收集各組細胞懸液，離心棄上清，200 μL binding buffer 重懸，5 μL Annexin V-FITC 染色孵育10 min，離心棄上清，200 μL binding buffer 重懸，10 μL PI染色，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

3統計學處理

所有數據均使用均數±標準差(mean±SD)表示。數據統計使用SPSS 20.0統計軟件包。比較STAT3和survivin的mRNA及蛋白水平采用兩獨立樣本t檢驗;不同濃度藥物作用的多組間比較采用單因素方差分析，多組間均數每兩個均數比較(兩兩比較)采用q檢驗，多組均數與一個對照樣本均數比較采用Dunnettt檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1細胞活力

MTT法檢測結果顯示與對照組相比較，Raji細胞490 nm處吸光度值在加入IL-6培養后顯著增高，加入AG490則明顯降低(P<0.05)，并且均呈濃度依賴性，見圖1。

2STAT3和survivin的mRNA表達

與相應的對照組之間比較， IL-6組Raji細胞中STAT3和survivin的mRNA表達明顯升高， AG490組Raij細胞中STAT3和survivin的mRNA表達明顯降低。不同濃度的IL-6組之間、不同濃度的AG490組之間，STAT3和survivin的mRNA表達亦有顯著差異(P<0.05)，且均呈現出藥物濃度依賴關系，見表2、3。

Figure 1.The effects of AG490 or IL-6 at different concentrations for different time on the growth of Raji cells. Mean±SD.n=3.

圖1AG490和IL-6對Raji細胞活力的影響

表2　加入IL-6處理Raji細胞48 h后的STAT3和survivin的mRNA相對表達量

*P<0.05vs0 μg/L.

表3　加入AG490處理Raji細胞48 h后STAT3和survivin的mRNA相對表達量

*P<0.05vs0 mg/L.

3p-STAT3和survivin蛋白水平的比較

Western blot檢測顯示，與相應的對照組相比，Raji細胞的p-STAT3及STAT3蛋白在AG490處理組明顯降低(P<0.05)，在IL-6處理組升高(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The protein levels of STAT3, p-STAT3 and survivin in the Raji cells with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2Western blot檢測Raji細胞中STAT3、p-STAT3和survivin的蛋白水平

4細胞凋亡的檢測

流式細胞術檢測顯示，在IL-6和AG490處理的細胞和對照組細胞之間凋亡水平有明顯差異(P<0.05)。細胞凋亡水平呈現出藥物濃度依賴關系，見圖3。

5細胞周期的檢測

與相應對照相比，AG490組G1期細胞百分率明顯升高(P<0.05)，S期細胞百分率無明顯變化，G2/M期細胞百分率明顯降低(P<0.05)；IL-6組G0/G1期細胞百分率明顯降低(P<0.05)，S期細胞百分率明顯升高(P<0.05)，G2/M期細胞百分率無明顯變化，見圖4、表4。

討論

Burkitt淋巴瘤是生發中心細胞來源的高侵襲性B細胞非霍奇金淋巴瘤，具有很差的預后。腫瘤細胞的倍增時間很短，與myc基因有關的染色體易位是該腫瘤的顯著特征，很多病例存在EB病毒感染。有研究發現, JAK/STAT3信號轉導通路在淋巴瘤[10-11]如彌漫大B細胞淋巴瘤侵襲及轉移過程中發揮重要作用[12], 該通路持續激活可導致細胞異常增殖或惡性轉化，應用該通路的抑制劑可抑制 STAT3 在侵襲性惡性淋巴瘤細胞系中的活性。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的一個成員[13]，它在多種腫瘤組織中高表達，而在癌旁組織及正常組織中無表達或低表達[14]。Survivin具有抑制細胞凋亡和調節細胞有絲分裂的雙重功能[15-16]。它主要通過多條通路的調節抑制caspase級聯反應中caspase-9、caspase-3、caspase-7的活性而發揮抗凋亡作用；在G2/M期特異性的表達，加快腫瘤細胞由G1/S期的轉換，通過有絲分裂促進轉化細胞的異常增殖。有報道survivin在侵襲性的非霍奇金淋巴瘤中表達并能預測一些非霍奇金淋巴瘤的臨床過程和預后，它的表達預示著非霍奇金淋巴瘤較差的預后[17-18]。同時有文獻報道在侵襲性淋巴瘤中survivin基因與cyclin B的結合在促進G2/M期的轉化中起重要作用[19]。多項研究表明[20-21]：survivin可能是STAT3信號通路下游靶基因之一。survivin基因的啟動子上含有STAT3的結合位點，活化的STAT3可直接與survivin基因的啟動子結合，調控survivin蛋白的表達，而向細胞中轉入survivin基因并穩定表達后，可逆轉STAT3抑制劑誘導的促凋亡作用。我們采用Burkitt淋巴瘤細胞行研究，用STAT3的小分子抑制劑AG490和激活劑IL-6，了解它們對腫瘤細胞生長的影響，并探討2種藥物對Raji細胞生長的影響是否與STAT3和survivin的變化有關，為尋找淋巴瘤生物治療的新靶標提供實驗依據。

AG490 是一種人工合成的苯亞甲基丙二腈的脂類衍生物，可以和受體酪氨酸激酶競爭結合位置，是JAK/STAT通路的特異性抑制劑[22]，應用AG490作用于腫瘤細胞而起抗瘤作用的研究陸續見諸報道，而作用于Burkitt 淋巴瘤的研究尚未見到。IL-6是IL-6/JAK信號通路的激活劑[23-24]，激活JAK后可激活STAT3的表達及磷酸化，形成二聚體結構進入細胞核，與下游凋亡及細胞周期調控基因、基質金屬蛋白酶等靶基因的啟動子結合，調節腫瘤細胞的增殖凋亡和遷移等過程。

本研究發現加入AG490后Raji細胞生長活力降低，在IL-6的作用下，細胞生長活力增強，都呈現出藥物濃度依賴關系。流式細胞術檢測發現加入AG490 48 h后，G0/G1期細胞比率由46.19%上升至51.65%，雖然S期細胞百分率下降不明顯，但G2/M期百分率明顯降低；加入IL-6 48 h后，G0/G1期的Raji細胞出現下降趨勢，S期細胞明顯增多。細胞的凋亡檢測分析發現在加入藥物24 h、48 h、72 h后，AG490組細胞凋亡率明顯增高，IL-6組凋亡率則明顯降低，兩者都呈現出藥物濃度依賴關系。這表明JAK/STAT3信號通路對Raji細胞的生長活力、細胞凋亡和細胞周期都產生明顯的影響。

Figure 3.The apoptotic levels of Raji cells treated with AG490 or IL-6 were analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.

圖3AG490或IL-6作用的各組Raji細胞的凋亡水平

為進一步探討IL-6和AG490影響Raji細胞生長的相關分子機制，我們用實時熒光定量PCR和Western blot檢查了survivin和STAT3的mRNA及蛋白表達水平。檢測分析發現，Raji細胞STAT3 mRNA的表達水平在AG490 作用后顯著降低，而IL-6作用后則明顯升高。STAT3和survivin mRNA的表達呈現藥物濃度依賴關系。與對照組相比，細胞內p-STAT3、STAT3和survivin蛋白表達在AG490作用 48 h后顯著降低， IL-6作用48 h后明顯升高，各組的STAT3、p-STAT3 與survivin蛋白變化都表現出一致性，提示survivin的蛋白表達可能與STAT3的活化有關。

Figure 4.The cell cycle distribution in the Raji cells under different treatments for 48 h. A: the Raji cells treated with AG490 at 50 mg/L; B: the Raji cells treated with IL-6 at 100 μg/L; C: control group.

圖4不同處理情況下Raji細胞培養48 h后細胞周期的變化

表4不同處理條件下Raji細胞培養48 h后細胞周期變化

Table 4.Proportion of the cell cycle in the Raji cells with diffe-rent treatment for 48 h (%. Mean±SD.n=3)

GroupG0/G1SG2/MControl46.51±2.0344.31±1.019.18±1.90AG49051.95±2.21*44.37±1.843.68±0.33*IL-640.81±2.29*49.94±2.59*9.25±1.71

*P<0.05vscontrol group.

實驗結果表明IL-6和AG490對Raji細胞的生長有明顯影響，其影響可能與STAT3分子活化及其上調survivin分子的表達密切相關。Survivin的上調表達可能是腫瘤細胞內STAT3 信號傳導途徑活化的結果，STAT3的活化通過上調survivin表達而抑制了腫瘤細胞的凋亡和促進細胞周期進程，從而影響Raji細胞的生長活力。抑制STAT3分子活化可能通過直接抑制STAT3活性、抑制survivin表達雙重作用對細胞生長產生明顯的抑制作用，這可能是Burkitt淋巴瘤治療的新思路。

[參考文獻]

[1]Morikawa T, Baba Y, Yamauchi M, et al. STAT3 expression, molecular features, inflammation patterns, and prognosis in a database of 724 colorectal cancers[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17(6): 1452-1462.

[2]Becker C, Fantini MC, Schramm C, et al. TGF-beta suppresses tumor progression in colon cancer by inhibition of IL-6 trans-signaling[J]. Immunity, 2004, 21(4): 491-501.

[3]Grivennikov S, Karin E, Terzic J, et al. IL-6 and Stat3 are required for survival of intestinal epithelial cells and development of colitis-associated cancer[J]. Cancer Cell, 2009, 15(2): 103-113.

[4]Lou W, Ni Z, Dyer K, et al. Interleukin-6 induces prostate cancer cell growth accompanied by activation of Stat3 signaling pathway[J]. Prostate, 2000, 42(3): 239-242.

[5]Berishaj M, Gao SP, Ahmed S, et al. Stat3 is tyrosine- phosphorylated through the interleukin-6/glycoprotein 130/Janus kinase pathway in breast cancer[J]. Breast Cancer Res, 2007, 9 (3):R32.

[6]Kim DY, Cha ST, Ahn DH, et al. STAT3 expression in gastric cancer indicates a poor prognosis[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2009, 24(4):646-651.

[7]侯嘉杰，孫倍成. STAT3:慢性炎癥介導腫瘤發生和進展的關鍵節點[J]. 生物化學與生物物理進展, 2014, 41(1):69-78.

[8]Jing N, Tweardy DJ. Targeting STAT3 in cancer therapy[J]. Anticancer Drugs, 2005, 16(6):601-607.

[9]Soldini D, Montagna C, Schüffler P, et al. A new diagnostic algorithm for Burkitt and diffuse large B-cell lymphomas based on the expression of CSE1L and STAT3 and on MYC rearrangement predicts outcome[J]. Ann Oncol, 2013, 24(1):193-201.

[10]Al Zaid Siddiquee K, Turkson J. STAT3 as a target for inducing apoptosis in solid and hematological tumors[J]. Cell Res, 2008, 18(2):254-267.

[11]Siveen KS, Sikka S, Surana R, et al. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1845(2):136-154.

[12]Lam LT, Wright G, Davis RE, et al. Cooperative signaling through the signal transducer and activator of transcription 3 and nuclear factor-κB pathways in subtypes of diffuse large B-cell lymphoma[J]. Blood, 2008, 111(7):3701-3713.

[13]Altieri DC. Survivin-The inconvenient IAP[J]. Semin Cell Dev Biol, 2015, 39:91-96.

[14]Mobahat M, Narendran A, Riabowol K. Survivin as a preferential target for cancer therapy[J]. Int J Mol Sci. 2014,15(2):2494-2516.

[15]Huang J, Lyu H, Wang J, et al. MicroRNA regulation and therapeutic targeting of survivin in cancer[J]. Am J Cancer Res, 2014, 5(1):20-31.

[16]R?del F, Sprenger T, Kaina B, et al. Survivin as a prognostic/predictive marker and molecular target in cancer therapy[J]. Curr Med Chem, 2012, 19(22):3679-3688.

[17]Kaneko N, Mitsuoka K, Amino N, et al. Combination of YM155, a survivin suppressant, with bendamustine and rituximab: a new combination therapy to treat relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma[J]. Clin Cancer Res, 2014, 20(7):1814-1822.

[18]Kaneko N, Kita A, Yamanaka K, et al. Combination of YM155, a survivin suppressant with a STAT3 inhibitor: a new strategy to treat diffuse large B-cell lymphoma[J]. Leuk Res, 2013, 37(9):1156-1161.

[19]Nefedova Y, Nagaraj S, Rosenbauer A, et al. Regulation of dendritic cell differentiation and antitumor immune response in cancer by pharmacologic-selective inhibition of the janus-activated kinase 2/signal transducers and activators of transcription 3 pathway[J]. Cancer Res, 2005 , 65(20):9525-9535.

[20]Scheper MA, Nikitakis NG, Sauk JJ. Survivin is a downstream target and effector of sulindac-sensitive oncogenic Stat3 signaling in head and neck cancer[J]. Int J Oral Maxillofac Surg, 2007, 36(7):632-639.

[21]Kanda N, Seno H, Konda Y, et al. STAT3 is constitutively activated and supports cell survival in association with survivin expression in gastric cancer cells[J]. Oncogene, 2004, 23(28):4921-4929.

[22]何平,李丹,李德天,等. 乙肝病毒X蛋白通過激活JAK2/STAT3信號通路調節腎小管上皮細胞凋亡[J]. 中國病理生理雜志, 2014,30(8):1451-1460.

[23]Garbers C, Aparicio-Siegmund S, Rose-John S. The IL-6/gp130/STAT3 signaling axis: recent advances towards specific inhibition[J]. Curr Opin Immunol, 2015, 34: 75-82.

[24]Munoz J, Dhillon N, Janku F, et al. STAT3 inhibitors: finding a home in lymphoma and leukemia[J]. Oncologist, 2014, 19(5):536-544.

(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

Effects of IL-6 and AG490 on Burkitt lymphoma cell growth

LI Pin-hao, YANG Wen-xiu, CHEN Qin, PEI Yuan-yuan

(DepartmentofPathology,GuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,China.E-mail:ypq1964@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the influences of IL-6 and AG490 on the growth of Raji cell line (Burkitt lymphoma cell, BL). METHODS: Raji cells were cultured. IL-6, an activator of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), and AG490, a specific inhibitor of STAT3 were added into the medium respectively. The expression of STAT3 and survivin at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blot. The cell viability was measured by MTT assay. Apoptosis and cell cycle were examined by flow cytometry. RESULTS: IL-6 or AG490 affected the growth of Raji cells significantly in a dose-dependent manner (P<0.05). The mRNA expression of STAT3 and survivin in Raji cells was higher in IL-6 group, and lower in the AG490 group than that in the corresponding control group. The statistical differences were found in the mRNA expression of STAT3 and survivin among different IL-6 or AG490 groups (P<0.05). The concentration dependent relationship was also presented in IL-6 and AG490 groups by the regression analysis. The results of Western blot showed that the protein levels of phosphorylated STAT3 (p-STAT3), STAT3 and survivin were increased in IL-6 group, and decreased in AG490 group. The apoptotic rate of Raji cells was gradually reduced with the increasing concentration of IL-6. The opposite results were detected in the Raji cells treated with AG490. There was significant difference in constitute of the cell cycle between the groups treated with IL-6 or AG490 and corresponding control group. The cells at G1-phase and G1/S were significantly increased, while those at S-phase had no obvious change under treating with AG490. The cells at S-phase decreased obviously in the Raji cells treated with IL-6. CONCLUSION: IL-6 and AG490 distinctly affect the growth of Raji cells. The mechanism may be associated with the activation of STAT3 and survivin.

[KEY WORDS]Burkitt lymphoma cells; Signal transducer and activator of transcription 3; Survivin

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.008

[中圖分類號]R730.23;R392.12

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0851-86752735； E-mail: ypq1964@163.com

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81160299)；貴州省優秀人才省長基金資助項目(No. 2011,125)

[收稿日期]2015- 04- 13[修回日期] 2016- 01- 21

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0432- 07

雜志網址： http://www.cjpp.net