miRNA-126對肺癌A549細胞的增殖、遷移、侵襲及EGFR/AKT/mTOR信號通路的影響*

唐夏莉，　焦德敏，　陳　君，　王　劍，　陳清勇

(中國人民解放軍第一一七醫院呼吸內科，浙江 杭州 310004)

?

miRNA-126對肺癌A549細胞的增殖、遷移、侵襲及EGFR/AKT/mTOR信號通路的影響*

唐夏莉，焦德敏，陳君，王劍，陳清勇△

(中國人民解放軍第一一七醫院呼吸內科，浙江 杭州 310004)

[摘要]目的： 探討微小RNA(microRNA,miRNA)-126對肺癌A549細胞功能的影響及相關的作用機制。方法: 利用脂質體試劑Lipofectamine 2000將miRNA-126轉染入肺癌A549細胞中，采用real-time PCR法檢測轉染后各組細胞中miRNA-126的表達；MTT法檢測細胞活力；臺盼藍拒染實驗檢測細胞存活數目；細胞集落培養實驗觀察轉染后細胞集落形成；劃痕愈合實驗檢測細胞的遷移能力；Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力；Western blot法檢測EGFR/AKT/mTOR通路中各蛋白水平的變化。結果: Real-time PCR結果顯示，轉染miRNA-126組細胞中的miRNA-126表達水平顯著高于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)，而陰性對照組與空白對照組無顯著變化；A549細胞轉染miRNA-126模擬物后，細胞增殖和集落形成能力均呈明顯下降(P<0.01)；肺癌細胞的遷移和侵襲能力也受到明顯抑制(P<0.01)；Western blot結果顯示，轉染miRNA-126組細胞中EGFR/AKT/mTOR通路相關蛋白p-EGFR、p-AKT和p-mTOR的水平均有明顯降低(P<0.01)。結論: miRNA-126可以顯著降低肺癌A549細胞中p-EGFR、p-AKT和p-mTOR的蛋白水平，進而可能抑制其細胞增殖和遷移侵襲能力。

[關鍵詞]微小RNA-126; EGFR/AKT/mTOR通路; 肺癌; 細胞增殖

肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤，研究表明其發病率和死亡率逐年升高[1]。在肺癌的許多分類中，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數的80%～85%[2]。肺癌早期診斷困難，大多確診已在晚期，因此迫切需要尋找一種靈敏度高、特異性強的早期肺癌診斷標記。微小RNA(microRNA，miRNA)是近年來發現的一大類內源性的非編碼單鏈小分子RNA。已有大量的研究表明microRNA參與腫瘤發生發展的全過程，在細胞增殖、凋亡、遷移等多個生物進程中發揮著類似癌基因或抑癌基因的作用。如miRNA-34a促進甲狀腺癌細胞增殖[3]，而miRNA-206則抑制肺癌細胞增殖和轉移[4]。本課題組在前期研究工作中利用miRNA表達譜芯片技術，發現miRNA-126在肺癌組織與癌旁組織中差異表達，并將miRNA-126轉染于肺癌A549細胞其增殖能力受到明顯抑制。因此，進一步觀察miRNA-126在肺癌中的功能及其作用機制，不僅有助于肺癌的早期診斷，也有助于為肺癌的臨床治療提供有效的干預靶點，為發展新型抗肺癌基因藥物提供理論依據。

材料和方法

1材料

非小細胞肺癌A549細胞購自中國科學院上海細胞所；has-miRNA-126-3p agomir引物序列、DMSO購自Sigma；胰蛋白酶和RPMI-1640培養基購自Gibco；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、臺盼藍染色細胞存活率檢測試劑盒購于碧云天生物公司；GAPDH、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、p-EGFR、AKT、p-AKT、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)和p-mTOR抗體購自CST。倒置熒光顯微鏡購自Leica; 凝膠成像系統和iMARK型全自動酶標儀購自Bio-Rad。

2主要方法

2.1細胞的瞬時轉染轉染前1 d，接種適量的細胞于不含抗生素的培養基中，根據脂質體Lipo-fectamine 2000的說明書進行細胞的轉染。分別用適量的Opti-MEM無血清培養液稀釋脂質體和has-miR-126-3p agomir，室溫孵育5 min后混合，室溫靜置20 min，將混合液加入到每孔中，輕輕晃動培養板混勻液體。將培養板放入培養箱中，6 h后替換為原培養基繼續培養。轉染帶熒光的FAM-NC時，所有操作均需避光操作，并以錫箔紙包被培養板放置培養箱中培養，轉染48 h后用PBS沖洗1次，熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

2.2Real-time PCR檢測miRNA-126的表達各組A549細胞經轉染48 h后，按照TRIzol說明書中步驟抽提細胞總RNA，取RNA于紫外分光光度計下測A260/A280，比值處于1.8～2.1之間則符合純度要求，按miRNA逆轉錄試劑盒說明配制逆轉錄試劑，逆轉錄合成cDNA，將合成的cDNA稀釋10倍，按real-time PCR說明書配制反應體系，每個樣本設3個復孔。PCR反應步驟：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。反應以U6為內參照。Has-miR-126-3p agomir的上游序列為5’-UCG UAC CGU GAG UAA UAA UGC G-3’，下游序列為5’-CAU UAU UAC UCA CGG UAC GAU U-3’。記錄各孔Ct值，取各孔平均值作為結果，并采用2-ΔΔCt法對結果進行分析。

2.3MTT法檢測細胞活力取對數生長期細胞以5.0×107/L的濃度接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養24 h，待細胞貼壁后，按上述轉染方法轉染肺癌A549細胞，另于標準空白孔中加不含細胞的完全培養液。轉染48 h后，每孔加入20 μL MTT(2 g/L)，繼續孵育4 h后，終止培養。吸去培養液，每孔加DMSO 150 μL，在酶標儀490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值。每組平行重復6孔，重復實驗3次。按以下公式計算：細胞存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。

2.4細胞存活數目檢測于6孔板中將miRNA-126轉染入肺癌A549細胞48 h后， 0.25%胰酶消化，用0.04%臺盼藍分別對control、negative control和miRNA-126組A549細胞進行染色，顯微鏡下計數活細胞數(其中著色細胞為死細胞)，每個樣品計數3次。

2.5細胞集落培養實驗于6孔板中轉染各組A549細胞24 h后，用0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min收集細胞，重懸細胞并計數，將細胞懸液作梯度倍數稀釋，以適當的細胞密度接種于培養皿中，并盡量使細胞均勻分布于板底，放入培養箱中連續培養10 d至肉眼可見集落時，棄原培養液，PBS洗滌1次后加10%甲醛固定15 min，PBS洗2次后用結晶紫染色30 min，PBS洗凈后晾干，拍照。重復實驗3次。

2.6劃痕愈合實驗將miRNA-126轉染肺癌A549細胞24 h后接種6孔板，待細胞鋪滿孔底，用10 μL槍頭小心在孔底劃痕，PBS清洗3次，加入含有2.5%低血清的新鮮培養基， 倒置顯微鏡下拍照，沿劃痕邊緣等間距取3處測量劃痕寬度，取平均值。24 h后繼續拍照，在相同觀察點測量劃痕寬度。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2.7Transwell小室實驗將miRNA-126轉染肺癌A549細胞24 h后，消化細胞于無血清培養基，將含有8×107/L細胞的200 μL細胞懸液加入鋪有基質膠的Transwell 小室上室，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培養基, 每組設置3個復孔，于37 ℃、5% CO2條件下培養24 h。取出Transwell小室，用棉簽擦掉Matrigel及上室未穿膜細胞，甲醇固定10 min，0.1%結晶紫染色40 min。100倍鏡下隨機選取5個視野計數穿膜細胞數目，取平均值。

2.8Western blot法檢測相關蛋白水平變化各組細胞經RIPA裂解液(1 mL RIPA+10 μL PMSF+10 μL aprotinin)裂解30 min，冰上進行操作。收集到EP管，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度定量。每個泳道蛋白樣品10 μg，經10% SDS-PAGE分離后，利用濕法將蛋白轉移至PVDF膜上，用含5% BSA的PBST封閉1 h，分別加入對應I 抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次后，加入對應II 抗室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL發光試劑盒發光顯影，定影后進行分析。

3統計學處理

所有實驗均重復3次，實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。多組間比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較應用Bonferroni檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1miRNA-126 agomir轉染肺癌A549細胞后上調miRNA-126的表達量

轉染miRNA-126 agomir可顯著提高miRNA-126在肺癌A549細胞中的表達量。miRNA-126組中miRNA-126的表達量相對陰性對照組及空白對照組明顯上調(P<0.01)，而陰性對照組和空白對照組之間差異不明顯。肺癌A549細胞經轉染48 h后，40 nmol/L的agomir可使肺癌A549細胞的miRNA-126表達量上調約800倍，見圖1。

2miRNA-126對肺癌A549細胞活力的影響

MTT法檢測結果顯示，miRNA-126組的生存率與NC組和control組相比，差異有統計學顯著性(P<0.01)，而NC組和control組相比差異無統計學顯著性。結果表明，上調miRNA-126表達后肺癌A549細胞的增殖能力被顯著抑制，見圖2。

3miRNA-126對肺癌A549細胞增殖的影響

miRNA-126轉染入肺癌A549細胞48 h后，用0.04%臺盼藍分別對A549細胞進行染色后，計算細胞的存活數目。miRNA-126組的細胞存活數目明顯減少，較空白對照組與陰性對照組比較差異有統計學顯著性(P<0.01)，見圖3。

Figure 1.The expression on miRNA-126 in the lung cancer A549 cells after transfection with miRNA-126 agomir. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC.

圖1定量PCR方法檢測細胞轉染miRNA-126 agomir 48 h后miRNA-126表達量的上調情況

Figure 2.The cell activity of lung cancer A549 cells after transfection with miRNA-126 by MTT assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC.

圖2MTT法檢測miRNA-126對肺癌A549細胞活力的影響

Figure 3.The number of viable A549 cells was counted by the method of Trypan blue exclusion. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC.

圖3臺盼藍拒染法檢測活細胞數目

4miRNA-126對肺癌A549細胞集落形成的影響

細胞集落培養實驗結果顯示，miRNA-126組集落形成數與NC組相比明顯減少(P<0.01)，細胞的增殖能力明顯受抑制，而NC組和control組集落形成數量的差異無統計學顯著性，見圖4。

Figure 4.Cell colony formation after transfection with miRNA-126. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC.

圖4轉染miRNA-126后細胞集落形成情況

5miRNA-126對肺癌A549細胞遷移侵襲能力的影響

劃痕愈合實驗及Transwell小室實驗檢測對肺癌A549細胞遷移侵襲能力的變化。結果顯示轉染miRNA-126后，肺癌A549細胞的遷移侵襲能力受到明顯的抑制。劃痕愈合實驗結果顯示，miRNA-126組劃痕愈合率較control組和NC組分別下降了24.76%和23.44%，但NC組和空白組之間的差異無統計學顯著性。miRNA-126組侵襲至Transwell小室濾膜下表面的細胞數為48.00±4.82，明顯低于control組(109.00±6.63)和NC組(107.00±5.25)，NC組和空白組之間的差異無統計學顯著性，見圖5。

6miRNA-126對EGFR/AKT/mTOR信號通路的影響

Western blot法檢測結果顯示，miRNA-126組與NC組相比， p-EGFR、p-AKT和p-mTOR水平均顯著下降(P<0.01)，NC組與對照組相比， p-EGFR、p-AKT和p-mTOR水平的差異無統計學顯著性，見圖6。

討論

MicroRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼雙鏈RNA 分子，在細胞增殖凋亡遷移等多個生物進程中發揮著類似癌基因或抑癌基因的作用。目前研究發現在多種腫瘤中表達下調，如肺癌[5]、骨肉瘤[6]、食管鱗癌[7]、肝癌[8]、胃癌[9]等腫瘤的研究中發現癌組織較正常組織表達下降。Liu等[10]研究甲基化測序分析發現miRNA-126位于EGFL7基因的內含子中，EGFL7基因啟動子的高甲基化導致miRNA-126的表達下調，過表達miRNA-126或抑制ADAM9的表達可下調EGFR/AKT信號活化，抑制食管磷癌細胞的體內外生長及遷移，該研究說明miRNA-126在腫瘤表達下調為表觀遺傳學機制所致。我們在前期研究中利用miRNA基因芯片技術也發現miRNA-126在肺癌組織與癌旁組織中差異表達，我們推測其在非小細胞肺癌組織中表達下調極可能也是由表觀遺傳學機制所致。

目前有關miRNA-126在肺癌中的研究較少，如Edit等[11]認為miRNA-126靶向作用于SLC7A5，延遲H69細胞G1期，從而抑制細胞增殖。Crawford等[12]的研究報道miRNA-126可能通過介導Crk蛋白的表達而抑制肺癌細胞的侵襲和遷移。Liu等[13]研究認為miRNA-126通過作用于VEGF表達抑制肺癌細胞增殖。本研究通過轉染miRNA-126使肺癌細胞中miRNA-126的表達量增加探討其對肺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲等生物學行為的變化，結果顯示過表達miRNA-126能顯著抑制肺癌A549細胞的增殖、遷移和侵襲。

Figure 5.The effect of miRNA-126 on A549 cell migration and invasion. A: the migration ability of A549 cells transfected with miRNA-126 was examined by wound healing assay; B: the invasion ability of A549 cells transfected with miRNA-126 was measured by Transwell assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC.

圖5miRNA-126對肺癌A549細胞遷移和侵襲能力的影響

Figure 6.The protein levels of p-EGFR, p-AKT and p-mTOR in the lung cancer A549 cells transfected with miRNA-126. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC.

圖6轉染miRNA-126對肺癌A549細胞EGFR/AKT/mTOR通路相關蛋白水平的影響

EGFR是表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)細胞增殖和信號傳導的受體。在多種惡性腫瘤中，EGFR發揮了重要作用，包括促進增殖、減少凋亡、提高腫瘤細胞運動能力和促進血管新生[14-15]等。EGFR突變導致其表達或活性異常，進而會促進腫瘤的發生。EGFR下游信號主要包括 PI3K/AKT、Ras/Raf/MEK/MAPK、STAT3等通路。Schettino等[16]研究認為 EGFR 在肺癌中過表達的發生率為37%～60%，并且臨床分期越晚，EGFR的表達越強，說明EGFR 的表達與肺癌的發生發展密切相關。然而，目前miRNA-126在肺癌中有關EGFR的信號通路研究尚不清楚。本實驗通過分析miRNA-126與EGFR信號通路分子間的相互關系，進一步明確miR-126在肺癌中的作用機制。研究結果顯示miRNA-126可以顯著降低肺癌A549細胞中p-EGFR、p-AKT和p-mTOR蛋白水平。說明miRNA-126可能通過下調EGFR/AKT/mTOR信號通路影響肺癌A549細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本實驗通過細胞轉染使肺癌A549細胞miRNA-126過表達，分析肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲等生物學行為變化，并探討引起這一變化的可能作用機制。實驗結果表明miRNA-126能夠抑制肺癌A549細胞的增殖、遷移和侵襲，同時抑制了EGFR/AKT/mTOR信號通路。我們還將繼續研究miRNA-126的靶基因，通過基因敲除或過表達該靶基因，進而構建穩定的細胞株，分析EGFR/AKT/mTOR信號通路與miRNA-126的靶基因之間的相互作用，將為miRNA-126應用于肺癌的臨床治療提供實驗依據。

[參考文獻]

[1]Chen QY, Zheng Y, Jiao DM, et al. Curcumin inhibits lung cancer cell migration and invasion through Rac1-dependent signaling pathway[J].J Nutr Biochem,2014, 25(2):177-185.

[2]Feng B, Zhang K, Wang R, et al. Non-small-cell lung cancer and miRNAs: novel biomarkers and promising tools for treatment[J]. Clin Sci, 2015, 128(10):619-634.

[3]Ma YF, Qin HD, Cui YF. MiR-34a targets GAS1 to promote cell proliferation and inhibit apoptosis in papillary thyroid carcinoma via PI3K/AKT/Bad pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013,441(4):958-963.

[4]Wang X, Ling C, Bai Y, et al. MicroRNA-206 is associated with invasion and metastasis of lung cancer [J]. Anat Rec, 2011, 294(1):88-92.

[5]Edin J, Matija R, Dragan K, et al. let-7b and miR-126 are down-regulated in tumor tissue and correlate with microvessel density and survival outcomes in non-small-cell lung cancer[J]. PLoS One, 2012,7(9): 45577-45586.

[6]Jiang LD, He AY, Zhang Q, et al. miR-126 inhibits cell growth, invasion, and migration of osteosarcoma cells by down regulating ADAM-9[J]. Tumour Biol, 2014, 35(12): 12645-12654.

[7]Nie ZC, Weng WH, Shang YS, et al. MicroRNA-126 is down-regulated in human esophageal squamous cell carcinoma and inhibits the proliferation and migration in EC109 cell via PI3K/AKT signaling pathway[J]. Int J Clini Exp Pathol, 2015, 8(5): 4745-4754.

[8]Zhao CF, Li Y, Zhang M, et al. miR-126 inhibits cell proliferation and induces cell apoptosis of hepatocellular carcinoma cells partially by targeting Sox2[J]. Human Cell, 2015, 28(2):91-99.

[9]Wang JQ, Chen XH, Su LP, et al. MicroRNA-126 inhibits cell proliferation in gastric cancer by targeting LAT-1[J]. Biomed Pharmacother, 2015, 72(6): 66-73.

[10]Liu RH, Gu J, Jiang P, et al. DNMT1-microRNA126 epigenetic circuit contributes to esophageal squamous cell carcinoma growth via ADAM9-EGFR-AKT signaling[J]. Clin Cancer Res, 2015, 21(4):854-863.

[11]Edit M, Zoltán M, Zsolt C, et al. miR-126 inhibits proliferation of small cell lung cancer cells by targeting SLC7A5[J]. FEBS Lett, 2011, 585(8): 1191-1196.

[12]Crawford M, Brawner E, Batte K, et al. MicroRNA-126 inhibits invasion in non-small cell lung carcinoma cell lines[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 373(4):607-612.

[13]Liu BO, Peng XC, Zheng XL, et al. MiR-126 restoration down-regulate VEGF and inhibit the growth of lung cancer cell linesinvitroandinvivo[J]. Lung Cancer, 2009, 66(2):169-175.

[14] Lee JG, Wu R. Erlotinib-cisplatin combination inhibits growth and angiogenesis through c-MYC and HIF-1α in EGFR-mutated lung cancerinvitroandinvivo[J]. Neoplasia, 2015, 17(2): 190-200.

[15]Xiao H, Tong RL, Ding CF, et al. γ-H2AX promotes hepatocellular carcinoma angiogenesis via EGFR/HIF-1α/VEGF pathways under hypoxic condition[J]. Oncotarget, 2015, 6(4):2180-2192.

[16]Schettino C, Bareschino MA, Sacco PC, et al. New molecular targets in the treatment of NSCLC[J]. Curr Pharm Des, 2013, 19(30):5333-5343.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

miRNA-126 inhibits proliferation, migration and invasion of human lung cancer A549 cells via EGFR/AKT/mTOR pathway

TANG Xia-li, JIAO De-min, CHEN Jun, WANG Jian, CHEN Qing-yong

(DepartmentofRespiratoryMedicine,The117thHospitalofPLA,Hangzhou310004,China.E-mail:cqy117@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of microRNA (miRNA)-126 on the proliferation, migration and invasion of human lung cancer cell lines, and to explore its mechanism. METHODS: The A549 cells were transfected with miRNA-126 agomir by Lipofectamine 2000. The expression of miRNA-126 was detected by real-time PCR. The cell activity was detected by MTT assay. The number of viable A549 cells was counted by the method of Trypan blue exclusion. The cell colony-forming capability was determined by cell colony formation test. The cell migration and invasion abilities were assayed by wound healing and Transwell methods, respectively. The protein levels of p-EGFR, EGFR, p-AKT, AKT, p-mTOR and mTOR were determined by Western blot. RESULTS: The expression level of miRNA-126 was significantly increased in the A549 cells compared with negative control (NC) group and control group (P<0.01). The proliferation of A549 cells was decreased extremely after transfected with the miRNA-126 agomir (P<0.01), so did the result of the cell colony-formation test. The migration and invasion abilities of the lung cancer cells were also significantly inhibited. The protein levels of p-EGFR, p-AKT and p-mTOR were significantly down-regulated compared with NC group and control group (P<0.01). CONCLUSION: Over-expression of miRNA-126 significantly inhibits the proliferation, migration and invasion ability of human lung cancer A549 cells by down-regulation of EGFR/AKT/mTOR pathway．

[KEY WORDS]MicroRNA-126; EGFR/AKT/mTOR pathway; Lung cancer; Cell proliferation

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.012

[中圖分類號]R730.23

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0571-28084872; E-mail: cqy117@163.com

*[基金項目]浙江省公益性技術應用研究計劃(No.2013C33209;No.2014C33277)；杭州市醫療衛生科研項目(No.20130633B29;No.20140633B40)

[收稿日期]2015- 09- 22[修回日期] 2015- 12- 03

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0458- 06

雜志網址： http://www.cjpp.net