慢性心衰大鼠下丘腦室旁核瞬時外向鉀通道蛋白Kv4.2和Kv4.3低表達促進腎交感神經興奮性*

馬柳一，　尹玉潔，　位　庚，　李紅蓉，　張軍芳，　劉　煥，　賈振華,3△

(1河北醫科大學，河北 石家莊 050017； 2河北以嶺醫藥研究院，國家中醫藥管理局重點研究室(心腦血管絡病)，河北 石家莊 050035； 3河北醫科大學附屬以嶺醫院心血管科(國家中醫藥管理局中醫絡病學重點學科)，河北 石家莊 050091)

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慢性心衰大鼠下丘腦室旁核瞬時外向鉀通道蛋白Kv4.2和Kv4.3低表達促進腎交感神經興奮性*

馬柳一1，尹玉潔1，位庚1，李紅蓉1，張軍芳2，劉煥1，賈振華1,3△

(1河北醫科大學，河北 石家莊 050017；2河北以嶺醫藥研究院，國家中醫藥管理局重點研究室(心腦血管絡病)，河北 石家莊 050035；3河北醫科大學附屬以嶺醫院心血管科(國家中醫藥管理局中醫絡病學重點學科)，河北 石家莊 050091)

[摘要]目的： 觀察慢性心衰大鼠下丘腦室旁核內瞬時外向鉀通道蛋白Kv4.2和Kv4.3的變化及其對交感神經活性的影響。方法: 采用冠狀動脈左前降支結扎術建立大鼠心衰模型或假手術模型，造模4周后超聲心動圖測定心功能；酶聯免疫吸附法測定血漿去甲腎上腺素(NE)及血清N端前腦鈉肽(NT-proBNP)含量；Western blot和real-time PCR法測定室旁核內Kv4.2和Kv4.3的表達情況；室旁核部位注射鉀通道阻滯劑4-氨基吡啶(4-AP)，電生理記錄儀記錄血壓、心率和腎交感神經放電的變化。結果: 與假手術組比，心衰組大鼠心功能明顯降低，血漿NE及血清NT-proBNP明顯升高，室旁核內Kv4.2和Kv4.3表達明顯下調；注射4-AP后導致血壓、心率和交感神經放電升高，但心衰組的升高幅度小于假手術組。結論: 心力衰竭時室旁核內Kv4.2和Kv4.3表達下調并伴有交感神經放電增加，促進心衰進展。

[關鍵詞]慢性心力衰竭； 交感神經； 下丘腦室旁核； 瞬時外向鉀通道蛋白

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是指由于心肌收縮力降低，使心輸出量不能滿足機體代謝的需要而引起的以循環功能障礙為主的綜合征。持續的交感神經過度激活是CHF的重要特征，其中樞調控機制是CHF發生發展的重要因素[1]。CHF時中樞神經元興奮性升高，交感神經活性明顯增強[2]。瞬間外向鉀通道廣泛分布于神經元和心肌細胞上，具有快速激活、快速失活及對4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)敏感等特性，介導動作電位復極化早期外向鉀電流，在調節中樞神經元興奮性和突觸傳遞以及維持神經元正常生理功能方面發揮重要作用[3]。參與CHF時交感神經激活的主要心血管中樞包括下丘腦室旁核(paraventricular nucleus of hypothalamus，PVN)、延髓頭端腹外側區(rostral ventrolateral medulla，RVLM)等。Gao等[4]發現心衰模型大鼠檢測到RVLM區域存在瞬時外向鉀通道Kv4.3 mRNA表達下調，膜片鉗技術檢測到RVLM區域神經元興奮性升高，當給予鉀通道阻滯劑4-AP時引起劑量依賴性的外周交感神經放電增強。而在心衰發病過程中PVN部位瞬間外向鉀通道對外周交感神經的調節尚不清楚。本研究構建慢性心衰大鼠模型，探討PVN部位瞬間外向鉀通道的變化對腎交感神經活性(renal sympathetic nerve activity，RSNA)的影響及其在CHF發生發展機制中的作用。

材料和方法

1材料和動物

1.1實驗動物成年雄性SD大鼠，40只，8周齡左右，體重200～220 g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[編號SCXK(京)2012-0001]。飼以標準飼料，自由進食飲水，光照12 h/d，溫度20～23 ℃，相對濕度40%～60%。

1.2試劑和儀器鉀通道阻滯劑4-AP、滂胺天藍(Sigma)；人工腦脊液(arificial cerebrospinal fluid, ACSF) 購自湖北英創生物科技有限公司；大鼠去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)和N端前腦鈉肽(NH2-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)酶聯免疫吸附試劑盒(CUSABIO)；小鼠抗大鼠Kv4.2和Kv4.3抗體(Abcam)；HX-300動物呼吸機、腦立體定位儀、ZH-RXZ型柔性顱骨鉆(淮北正華生物儀器有限公司)；PowerLab信號采集系統(Ad Instruments)；DP301生物電放大器(Warner Instruments)；玻璃分針及鉑絲電極(自制)。

2方法

2.1心衰模型的建立及分組大鼠隨機分為2組：假手術(sham)組和CHF組。用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，經口腔氣管插管連接小動物呼吸機進行機械通氣(潮氣量30～32 mL，呼吸比1∶2，呼吸頻率90次/分)。撕開胸膜，暴露心臟，待大鼠心電、呼吸平穩后，在無菌調節下，經左胸骨旁第2～3肋沿著肋間隙切開皮膚(切口約1 cm左右)，經切口處放入小動物開胸器，打開心包，推開胸腺，輕輕撥開左心耳，于左心耳下距主動脈根約1.5 mm處結扎左冠狀動脈前降支(假手術組只穿線不結扎)。沿肋骨對緣縫合，關閉胸腔，分層縫合胸壁。大鼠恢復自主呼吸后，拔出氣管插管，腹腔注射青霉素。待大鼠蘇醒后放入籠中正常飼養。

2.2大鼠心功能測定術后喂養4周超聲測定心功能變化，采用射血分數(ejection fractions，EF)<42%作為評定心力衰竭的標準[5]；取下大鼠心臟及肺臟稱重，心重和肺重與大鼠體重的比值即為心重指數和肺重指數。

2.3大鼠血漿NE及NT-proBNP含量的檢測腹主動脈采血，抗凝處理，4 ℃、3 000 r/min，離心15 min，分別取上清于EP管中，-80 ℃冷凍保存備用。ELISA法測定血漿NE及血清NT-proBNP水平，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.4Western blot實驗大鼠斷頭、取腦后依據大鼠腦定位圖譜于PVN區域打孔，提PVN至EP管中[6]，取組織加入裂解液中，冰浴勻漿，充分裂解，離心收集上清，用Nanodrop 2000分光光度計進行蛋白定量。待冷卻，進行電泳分離蛋白。凝膠電泳完畢后對凝膠進行半干轉膜。轉膜完畢，封閉液中封閉2 h。將封閉后的PVDF膜置入TBST稀釋(1∶1 000)的I抗溶液中，4 ℃緩慢搖動過夜。取出PVDF膜放入盛有適量TBST的平皿中，室溫洗膜。將PVDF膜置入適量以TBST 1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的II抗溶液中，于室溫反應2 h?？贵w結合區帶用化學發光法檢測。

2.5Real-time PCR取組織于冰浴勻漿器中，加入1 mL TRIzol，迅速研磨成勻漿液，加入200 μL氯仿振蕩30s，冰上放置5 min、4 ℃、12 000 r/min，離心10 min，取上層水加入等體積的異丙醇，-20 ℃靜置2 h。4 ℃、12 000 r/min，離心20 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇，輕輕混勻，4 ℃、12 000 r/min，離心10 min，加入20 μL DEPC處理的去離子水溶解沉淀，-80 ℃保存備用。提取后對RNA純度與完整性進行檢測；反轉錄，SYBR Green熒光定量PCR的檢測；進行實時熒光定量PCR結果分析，最后以GAPDH為內參照基因對比，得到目的基因的相對定量 (relative quantitation，RQ)值，將RQ值用于統計分析。

2.6血壓、心率和腎交感神經活性的測定每組實驗大鼠隨機抽取6只，10%水合氯醛腹腔麻醉后，將大鼠固定于手術臺上，沿股動脈走向縱向切開皮膚，用蚊式鉗鈍性分離組織，暴露左側股靜脈，右側股動脈，用眼科鑷或玻璃分針順著血管走向鈍性分離，行左側股靜脈插管以靜脈給藥，右側股動脈插管，導管接壓力換能器，與橋式放大器相連，PowerLab系統采集信號，持續監測平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)、心率(heart rate，HR)和RSNA。之后動物取俯臥位，利用門齒鉤、雙側耳棒將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，沿矢狀縫做皮膚切口暴露顱骨，調整前囟和后囟至同一水平。PVN定位：B=1.8 mm，L=0.4 mm，H=7.9 mm[7]。B表示前囟向后，L表示正中線左右旁開，H表示硬腦膜下深度。電鉆顱骨鉆孔，動物取右側臥位，經腰部縱行切口沿腹膜后路徑暴露左側腎臟，在解剖顯微鏡下找到左側腎動脈和腎神經，分離腎交感神經，掛于雙極珀金絲銀絲電極，滴加37 ℃石蠟油保持濕潤，接生物電放大器，PowerLab生物信號系統采集信號。在PVN部位先后微量注射200 nL的ACSF及等體積不同濃度的(2、4、8 nmol/μL)鉀通道阻滯劑4-AP，每次給完藥后開始計時，連續觀察微量注射ACSF及藥物對MAP、HR、RSNA的影響，每次給藥時間間隔30 min。而后將體積50 nL的滂胺天藍緩慢注入PVN，取出腦組織冰凍切片觀察藥物是否進入PVN，定位不準確的舍去。

3統計學處理

采用SPSS 19.0軟件處理，所有數據用均數±標準差(mean±SD)表示，RSNA對不同劑量藥物的反應以在基線基礎上的變化百分率表示，而血壓和心率對不同種類和不同劑量藥物的反應則以實測值和基線值之差(即變化值)表示。2組內數據分析使用配對設計t檢驗，2組間數據分析使用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1大鼠心功能評價

左冠脈結扎術后4周，超聲檢查可見CHF組大鼠存在不同程度的心尖區或心前壁變薄，室壁運動減弱。結果顯示，與sham組相比，CHF組左室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic dimension，LVDd)、左室收縮末期內徑(left ventricular end systolic dimension，LVDs)、左室舒張末期容積(left ventricular end diastolic volume，LVVd)和左室收縮末期容積(left ventricular end systolic volume，LVVs)明顯增高，EF及短軸縮短率(fractional shortening，FS)明顯降低，心重指數(heart weight/body weight，HW/BW)和肺重指數(lung weight/body weight，LW/BW)明顯升高(P<0.01)，見表1。

表1假手術組和心衰組大鼠超聲心動圖指標、心重指數和肺重指數結果比較

Table 1.The comparison of echocardiogram, HW/BW and LW/BW of sham-operated and CHF rats (Mean±SD.n=9)

IndexShamCHFLVDd(mm)6.14±1.049.73±0.46**LVDs(mm)3.54±0.748.71±0.60**LVVd(mL)0.58±0.271.93±0.28**LVVs(mL)0.12±0.061.42±0.28**EF(%)78.22±8.3326.11±6.35**FS(%)42.44±7.9710.33±2.78**HR(beats/min)352.11±70.13382.89±42.56HW/BW(mg/g)2.62±0.273.16±0.13**LW/BW(mg/g)3.33±0.384.94±0.57**

**P<0.01vssham group.

2ELISA法測定血漿中NE水平及血清NT-proBNP水平

與假手術組比較，CHF組血漿NE及血清NT-proBNP含量均顯著升高(P<0.01),見表2。

表2大鼠血漿NE及血清NT-proBNP 檢測結果的比較

Table 2.The changes of NE, NT-proBNP in the rats with different treatments (Mean±SD.n=9)

GroupNE(μg/L)NT-proBNP(ng/L)Sham2.28±0.12244.43±16.80CHF3.33±0.40**286.70±13.61**

**P<0.01vssham group.

3Western blot和 real-time PCR檢測Kv4.2、Kv4.3的表達

利用Western blot和 real-time PCR檢測Kv4.2、Kv4.3表達，與sham組比較，CHF組Kv4.2、Kv4.3表達蛋白及mRNA均明顯降低，見圖1。

Figure 1.The protein (A) and mRNA (B) expression of neuronal Kv4.2，Kv4.3 in the punched paraventricular nucleus tissues measured by Western blot and real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vssham.

圖1Western blot和real-time PCR檢測下丘腦室旁核Kv4.2、Kv4.3的表達情況

4微量注射4-AP后大鼠血壓、心率和腎交感神經放電變化情況

與ACSF組比較，sham組和CHF組大鼠室旁核內注射鉀通道阻滯劑4-AP(2、4、 8 nmol/μL)劑量依賴性地導致血壓、心率、交感神經放電的顯著增強(P<0.05)；但與sham組比較，CHF組血壓、心率、交感神經放電升高幅度顯著減小(P<0.01)，見圖2。

討論

本研究采用SD大鼠冠狀動脈左前降支結扎導致心梗后心衰模型，4周后可見CHF組HW/BW和LW/BW明顯升高，有統計學顯著性；超聲心動圖顯示CHF組LVDd、LVDs、LVVd和LVVs明顯增高，EF和FS明顯降低，差異有統計學顯著性；NT-proBNP是臨床上評定CHF的金標準，CHF組NT-proBNP明顯高于假手術組，差異有統計學顯著性。表示CHF模型制作成功。

CHF是心臟泵血功能障礙與代償性激活的神經體液因子相互作用為特征的臨床綜合征，是多種心血管疾病的終末階段。中樞神經系統的激活是CHF發生發展的重要機制，主要通過影響外周交感神經活動加重心衰進展[1]。鉀離子通道的多樣性決定了中樞神經元放電模式及生理功能的多樣性[8-9]。瞬時外向鉀通道通過影響動作電位的形成及形態，調節動作電位的頻率，調整靜息膜電位等影響神經功能活動而受到關注[10-11]。中樞神經系統Kv4.x通道是調節瞬時外向鉀電流(transient outward potassium current，Ito)主要成分[12]。3個不同的基因編碼Kv4.x家族，包括Kv4.1、Kv4.2和Kv4.3，后兩者是中樞部位調節神經元興奮性的主要亞基成分[13]。Gao等[4]發現CHF大鼠中樞RVLM部位Kv4.3蛋白表達量下降；有趣的是，研究者在CHF病人心肌細胞及高血壓模型大鼠心肌細胞也發現同樣現象[14-15]。這些數據表明心衰或高血壓狀態下外周和中樞組織存在鉀通道蛋白表達的下調。本實驗通過Western blot和real-time PCR實驗發現心衰大鼠PVN部位鉀通道的Kv4.2和Kv4.3蛋白和mRNA表達較假手術組明顯降低，與上述報道一致。PVN是中樞內的整合區域，是調節交感神經活動的關鍵腦區，激活PVN會導致血壓的升高和交感神經活動的增強。有研究發現高血壓大鼠PVN部位由鉀通道介導的電流下調，而鈣通道介導的電流上調，這種電流之間的翻轉增強了細胞膜的興奮性[16]。因此我們推測心衰時PVN部位Kv4.2和Kv4.3的下調降低了Ito，導致了神經細胞興奮性的增強。

Figure 2.The changes of MAP, RSNA, HR after microinjection of 4-AP into the paraventricular nucleus of the hypothalamus. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsACSF;##P<0.01vssham.

圖2微量注射4-AP后大鼠平均動脈壓、心率和腎交感神經放電活性改變的比較

為了驗證鉀通道蛋白Kv4.2和Kv4.3低表達在慢性心衰中的作用，本實驗大鼠PVN微量注射瞬時外向鉀通道蛋白阻滯劑4-AP后，引起劑量依賴性血壓、心率、腎交感神經放電增強，這些數據表明降低PVN部位鉀電流會造成交感神經活性增強。值得注意的是，與假手術組相比，CHF組PVN注射4-AP后血壓、心率、腎交感神經放電升高幅度顯著降低，提示CHF時PVN的鉀通道蛋白低表達造成的交感神經去抑制可能是參與CHF交感神經興奮性增強的作用機制之一。

綜上所述，慢性心衰時交感中樞部位瞬時外向鉀離子通道表達量的下調造成的PVN神經元自主性放電及興奮性的增強可能是心衰交感神經興奮性增強的作用機制之一，這為慢性心衰的病理生理研究和治療提供了依據。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

Downregulated transient outward potassium channel protein Kv4.2 and Kv4.3 expression in PVN contributes to sympathoexcitation in rats with chronic heart failure

MA Liu-yi1, YIN Yu-jie1, WEI Geng1,LI Hong-rong1, ZHANG Jun-fang2, LIU Huan1, JIA Zhen-hua1, 3

(1HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China;2DepartmentofCardiology,YilingMedicalInstituteofHebeiProvince,KeyLaboratoryofStateAdministrationofChineseMedicine(Cardio-cerebralVascularCollateralDisease),Shijiazhuang050035,China;3DepartmentofCardiology,YilingHospitalofHebeiMedicalUniversity(CollateralDiseaseTheoryKeyDisciplineofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine),Shijiazhuang050091,China.E-mail:jiatcm@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the transient outward potassium channel protein expression in paraventricular nucleus (PVN) and its contribution to renal sympathetic nerve activity (RSNA) in rats with chronic heart failure (CHF).METHODS: A rat model of CHF was prepared by acute myocardial infarction that was induced by ligation of the left anterior descending coronary artery. Four weeks after heart failure, echocardiogram was applied to identify the CHF model and plasma norepinephrine (NE), serum NH2-terminal pro-brain natriuretic peptide (NT-proBNP) were detected by ELISA. The expression of ransient outward potassium channel proteins Kv4.2 and Kv4.3 at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot. The mean arterial pressure (MAP), heart rate (HR) and RSNA were measured in anesthetized rats with PVN microinjection of potassium channel blockers 4-AP. RESULTS: In CHF group, the rat cardiac function and Kv4.2 and Kv4.3 expression in PVN were obviously lower while plasma NE and serum NT-proBNP were obviously higher than those in sham group. Microinjection of 4-AP into PVN induced an increase in MAP, HR and RSNA in both sham and CHF rats, while the CHF rats exhibited smaller responses to 4-AP than sham-operated rats.CONCLUSION: Downregulation of Kv4.2 and Kv4.3 expression in the PVN may be a potential mechanism for sympathoexciation in the rats with chronic heart failure.

[KEY WORDS]Chronic heart failure; Sympathetic nervous; Hypothalamic paraventricular nucleus; Ransient outward potassium channel protein

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.022

[中圖分類號]R541.6； R363

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0311-66703020; E-mail: jiatcm@163.com

*[基金項目]國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(No.2012CB518606)；國家自然科學基金資助項目(No.81273978)

[收稿日期]2015- 10- 28[修回日期] 2015- 12- 11

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0522- 06

雜志網址： http://www.cjpp.net

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