瑞舒伐他汀聯合厄貝沙坦對大鼠心肌肥厚性重構的影響

張　斌，　湯建民，　楊　蕾，　楊雁華

(鄭州大學第二附屬醫院心內科，河南 鄭州 4500H14)

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瑞舒伐他汀聯合厄貝沙坦對大鼠心肌肥厚性重構的影響

張斌，湯建民△，楊蕾，楊雁華

(鄭州大學第二附屬醫院心內科，河南 鄭州 4500H14)

[摘要]目的： 探討瑞舒伐他汀聯合厄貝沙坦對心肌肥厚大鼠心室重構的影響。方法: SPF級體重240～300 g雄性SD大鼠50只隨機分為對照組、模型組、瑞舒伐他汀組、厄貝沙坦組和聯合組。除對照組外，其余4組大鼠連續14 d給予皮下注射異丙腎上腺素(2.5 mg/kg)。自造模當天開始，對照組和模型組給予生理鹽水灌胃，瑞舒伐他汀組、厄貝沙坦組和聯合組分別給予瑞舒伐他汀(4 mg·kg-1·d-1)、厄貝沙坦(15 mg·kg-1·d-1)和瑞舒伐他汀(4 mg·kg-1·d-1)+厄貝沙坦(15 mg·kg-1·d-1)灌胃處理，連續干預4周。干預結束后，分別測定各組大鼠心臟質量指數、左室質量指數，HE染色觀察心肌細胞肥大程度，RT-PCR測定肥大相關因子ANF、β-MHC和AT1受體(AT1R)的mRNA表達，Western blot法測定AT1R的蛋白表達。結果: 與對照組相比，模型組的心臟質量指數、左室質量指數、ANF和β-MHC的mRNA表達均增加(P<0.05)；與模型組相比，瑞舒伐他汀組和厄貝沙坦組的心臟質量指數、左室質量指數、ANF和β-MHC 的mRNA表達均降低(P<0.05)，聯合組效果優于單藥組(P<0.05)。瑞舒伐他汀組及厄貝沙坦組AT1R的mRNA及蛋白表達均低于模型組(P<0.05)，而聯合組AT1R的mRNA及蛋白表達水平低于各單獨用藥組(P<0.05)。結論: 瑞舒伐他汀及厄貝沙坦均能不同程度地改善心肌肥厚。它們的抗心肌肥厚作用可通過下調AT1R的mRNA和蛋白表達實現。聯合用藥的效果優于單一藥物。

[關鍵詞]心肌肥厚； 瑞舒伐他汀； 厄貝沙坦； AT1受體

心肌肥厚(cardiac hypertrophy)是形成心力衰竭的病理生理基礎，是心力衰竭、冠心病、猝死等的獨立危險因素[1-2]。研究心肌肥厚與心肌重構的病理發生、發展過程及機制，預防并及時治療心肌肥厚，對于降低病人發病率、死亡率及提高生活質量具有重要意義。臨床上常規選用血管緊張素轉化酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)、血管緊張素受體阻斷劑(angiotensin receptor blocker，ARB)、醛固酮拮抗劑等藥物改善心室重構，近幾年眾多文獻證實他汀可通過調控多條不同的信號轉導途徑發揮抗心肌肥厚作用。盡管他汀類及ARB類藥物抗心肌肥厚的作用被眾多實驗及臨床研究證實，但是在ARB類藥物治療的基礎上加用他汀，藥理機制完全不同的這兩類藥物同時服用是否產生協同或累積效應以及改善心室肥厚藥理機制，目前相關文獻報道較少。研究表明AT1受體在心肌肥厚及心肌重構中發揮著最為重要的作用[3]。血管緊張素II作用于AT1受體，通過PLC-IP3、DAG-PKC信號轉導通路誘導原癌基因c-fos、c-myc轉錄表達，增加心肌細胞內DNA、RNA的含量，增加蛋白質的合成，誘發心肌細胞增殖及心室重構，其與心肌肥厚密切相關[4]。研究已表明ARB類藥物可通過阻斷Ang Ⅱ與AT1 受體結合及降低心肌Ang Ⅱ水平及AT1受體的親和力, 從而逆轉左室肥厚。Ichiki等[5]的文獻報道西利伐他汀及氟伐他汀可使AT1受體mRNA的表達減少，進而拮抗AT1受體介導的心肌肥厚。故我們假設兩者通過影響AT1受體表達及阻斷血管緊張素II與AT1受體的結合發揮更強及有效的抗心肌肥厚作用。本實驗通過皮下注射異丙腎上腺素造成大鼠心肌肥厚，并用瑞舒伐他汀及厄貝沙坦進行治療，來探討這2種藥物抗心肌肥厚的作用及對AT1受體的影響，為臨床抗心肌重構及治療心力衰竭提供實驗依據。

材料和方法

1材料

1.1實驗動物及分組50只SD雄性大鼠，體質量240～300 g，購自河南省動物實驗中心。于SPF級動物房內適應性喂養7 d 后分為5組: 空白組、模型組、瑞舒伐他汀組(4 mg·kg-1·d-1)、厄貝沙坦組(15 mg·kg-1·d-1)和聯合組(瑞舒伐他汀4 mg·kg-1·d-1+厄貝沙坦15 mg·kg-1·d-1)，每組10只。

1.2實驗試劑瑞舒伐他汀(可定)由阿斯利康制藥有限公司饋贈；厄貝沙坦(科蘇)由北京海燕藥業有限公司饋贈；異丙腎上腺素注射液購自上海禾豐制藥有限公司；RNA提取試劑盒、PCR試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3主要儀器設備PCR GeneAmp System 2700(Applied Biosystems)電泳儀DYY-6C(北京市六一儀器廠)；顯微攝影儀(Olympus)。

2方法

2.1實驗動物造模及給藥空白組皮下注射生理鹽水1 mL，其它各組大鼠每天用異丙腎上腺素(2.5 mg/kg)經腹部皮下注射14 d得到心肌肥厚模型。造模第1天開始, 將瑞舒伐他汀和厄貝沙坦研磨成粉，溶于少量蒸餾水中制成懸液,采用灌胃法給藥，空白組和模型組大鼠均用等量生理鹽水灌胃。每日上午定時1次，共4周。造模期間模型組死亡3只，瑞舒伐他汀組死亡2只，厄貝沙坦死亡1只，聯合組死亡2只。

2.2心臟重量參數測定4周后大鼠稱體重(body weight，BW)，麻醉，消毒，打開胸腔剪取心臟，沖洗干凈，濾紙吸干后稱心臟質量(heart mass，HM)，分離出左心室，稱左心室質量(left ventricular mass，LVM)。心臟質量指數(heart mass index，HMI)=HM/BW，左室質量指數(left ventricular mass index，LVMI)=LVM/BW。

2.3蘇木紫-伊紅染色常規進行HE染色，顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織病理切片并拍照。

2.4RT-PCR 法測定心房鈉尿肽(atrial natriuretic factor,ANF)、β-MHC及AT1受體的mRNA 表達剪去大鼠心肌，向組織中加入適量的RNAisoPlus，提取RNA，逆轉錄成cDNA，RT-PCR 法檢測心肌肥厚相關因子ANF及β-MHC的mRNA表達，β-MHC的上游引物為5’TGCCAGCGAGTCGTCAGT-3’，下游引物為5’TCTCCACCGCATCCACAA-3’，擴增片段為338 bp；ANF 的上游引物為5’TGGAGCAAATCCCGTATA-3’，下游引物為5’GAGCAGAGCCCTCAGTTT-3’，擴增片段為289 bp；AT1受體的上游引物為5’TCTCCACCGCATCCACAA-3’，下游引物為5’AGACCCTCTGTCCAACCC-3’，擴增片段為145 bp；GAPDH的上游引物為5’TGGAGCAAATCCCGTATA-3’，下游引物為5’-GAGCAGAGCCCTCAGTTT-3’，擴增片段為588 bp。循環條件為:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s， 72 ℃ 45 s，35 個循環;72 ℃ 5 min。擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，結果以目的條帶和內參照吸光度比值表示，GAPDH 作為內參照。

2.5Western blot法檢測AT1受體蛋白的表達向組織中加入適量蛋白裂解液，用組織細胞勻漿器勻漿至組織充分裂解，提取大鼠心肌總蛋白，BCA法測蛋白濃度，調整蛋白濃度至上樣量一致。加等量蛋白于加樣孔中，電泳，半干法轉膜，5%脫脂奶粉封閉，I抗孵育過夜，洗膜，II抗孵育，洗膜，顯色。顯影之后分析所測電泳條帶的性質。β-actin作為內參照。

3統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，Bonferroni法行各組均數間兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1大鼠HWI和LVWI的測定

與對照組相比，模型組及藥物干預組的HMI和LVMI增加，差異有統計學顯著性(P<0.05)。與模型組相比，藥物干預組的HMI和LVMI下降(P<0.05)，且聯合組的HMI和LVMI下降程度優于單藥組(P<0.05)，見表1。

表1不同藥物處理對大鼠HMI和LVMI的影響

Table 1.The effects of different treatments on HMI and LVMI of rats (Mean±SD)

GroupnHMILVMIControl102.47±0.071.78±0.07Model73.38±0.11*2.31±0.15*Rosuvastatin83.21±0.07#2.24±0.06#△Irbesartan93.07±0.08#2.11±0.09#△Combination82.87±0.14#1.98±0.12#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vscombination group.

2心肌細胞病理學改變

對照組大鼠心肌細胞排列整齊、規則；與對照組相比，模型組心肌細胞肥大、排列紊亂，而藥物干預組較模型組心肌細胞偏小，聯合組較單藥組心肌細胞偏小，見圖1。

Figure 1.The pathological changes of rat myocardial tissues with HE staining (×400). A: control group; B: model group; C: rosuvastatin group; D: irbesartan group; E: combination group.

圖1各組大鼠心肌HE染色

3大鼠心肌ANF 和β-MHC的mRNA 相對表達量的比較

模型組ANF和β-MHC 的mRNA 表達水平高于對照組(P<0.05)，而瑞舒伐他汀組、厄貝沙坦組、聯合組ANF及β-MHC的mRNA 表達水平較模型組均下降(P<0.05)；聯合組與單藥組相比，ANF及β-MHC的mRNA 表達水平下降，差異具有統計學顯著性(P<0.05),見圖2。

4大鼠心肌組織AT1受體mRNA相對表達量的比較

模型組大鼠心肌組織中AT1受體的mRNA表達量升高，與對照組相比差異有統計學顯著性(P<0.05)。各藥物干預組大鼠心肌組織中AT1受體的mRNA表達與模型組相比差異有統計學顯著性(P<0.05)，其中與單藥組相比，聯合組AT1受體的mRNA表達量下降，差異具有統計學顯著性(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.The mRNA expression of ANF and β-MHC in rat myocardial tissues. 1: control group; 2: model group; 3: rosuvastatin group; 4: irbesartan group; 5: combination group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vscombination group.

圖2大鼠心肌組織 ANF及β-MHC的mRNA表達

5大鼠心肌組織AT1受體蛋白的相對表達

模型組大鼠心肌組織AT1受體蛋白表達明顯增加，與對照組相比差異有統計學顯著性(P<0.05)；與模型組相比，瑞舒伐他汀組、厄貝沙坦組和聯合組大鼠心肌組織的AT1受體蛋白表達明顯下降，差異有統計學顯著性(P<0.05)，聯合組AT1受體蛋白的表達量低于各單獨用藥組(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.The mRNA expression of AT1R in rat myocardial tissues. 1: control group; 2: model group; 3: rosuvastatin group; 4: irbesartan group; 5: combination group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vscombination group.

圖3大鼠心肌組織 AT1R的mRNA表達

Figure 4.The protein expression of AT1R in rat myocardial tissues.1: control group; 2: model group; 3: rosuvastatin group; 4: irbesartan group; 5: combination group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vscombination group.

圖4大鼠心肌組織 AT1R蛋白的表達

討論

心肌肥厚是心肌組織超負荷的一種代償性反應，其發病機制、藥物治療機制經多年研究尚未完全闡明。異丙腎上腺素是一種兒茶酚胺類藥物，通過結合及激動β腎上腺素受體，增強心肌收縮力，增快心率，心肌間質纖維增生，進而誘導心肌肥厚[6]。而心肌肥厚可通過動物心臟、左心室質量的變化情況、心臟超聲測定心功能、HE染色觀察細胞面積與排列的變化以及測定肥大相關因子如ANP、BNP 和β-MHC在mRNA或者蛋白水平的改變來評價心肌肥厚模型的建立效果[7-8]。本研究通過對大鼠皮下注射異丙腎上腺素構建心肌肥厚模型，結果表明與對照組相比，模型組的心臟質量指數、左室質量指數、肥大相關因子ANF和β-MHC的 mRNA表達均明顯升高，提示心肌肥厚模型造模成功。

研究表明他汀類藥物除降血脂作用，還具有抗炎、抗氧化、改善血管內皮功能、抗心肌重構、穩定動脈粥樣硬化斑塊、治療心衰等其它心血管保護作用[9]。眾多國內外文獻均報道他汀可以通過對多條不同信號轉導通路的調控，發揮改善心室重構及抗心肌肥厚的作用。而ARB類藥物抑制心肌細胞增生, 延遲或逆轉心肌肥厚的作用目前已經得到廣泛認同。這2種不同藥理作用機制的藥物聯合應用理論上應能產生累積或協同效應。Lee等[10]報道對心肌梗死后左室肥厚的大鼠，奧美沙坦與普伐他汀聯用較各自單用更能有效降低心肌細胞面積及ANP 的mRNA表達。Sohma等[11]報道血管緊張素受體阻滯劑與他汀類藥物聯合應用對逆轉左室肥厚有協同作用。李建新[12]報道阿托伐他汀與厄貝沙坦有協同增效的逆轉左心室肥厚作用。本研究表明，瑞舒伐他汀組、厄貝沙坦組干預后心臟質量指數、左室質量指數、肥大相關因子ANF和β-MHC的mRNA表達均顯著降低，說明瑞舒伐他汀及厄貝沙坦均能有效緩解異丙腎上腺素所致的心肌肥厚，而聯合組較單用藥物組更為明顯，差異有統計學顯著性。這與Sohma等[11]的研究結果相一致。

雖然聯合應用他汀及血管緊張素受體阻斷劑抗心肌肥厚的協同作用已逐步被認可[10-12]，但聯合這兩類藥物進一步改善心肌肥厚的藥理作用機制仍不清楚。現研究證明，誘導心肌肥厚大鼠的心肌細胞AT1受體表達增強，AT1受體在心肌肥厚及心肌重構中發揮著最為重要的作用[13]。我們知道血管緊張素是促進心肌細胞和血管平滑肌細胞增殖肥厚的刺激因子，而AngII大部分生物效應就是通過AT1受體介導的。研究表明，他汀類藥物可直接下調AT1受體的表達[14]。Nickenig等[15]研究表明在高膽固醇血癥人群中應用他汀類藥物可有使AT1受體的表達減少。崔曉瓊等[16]報道阿托伐他汀可通過下調AT1受體的基因表達從而發揮抑制心肌細胞肥大的作用。而血管緊張素受體阻滯劑本身就可通過阻斷Ang Ⅱ與AT1 受體結合及降低心肌Ang Ⅱ水平及AT1受體的親和力, 從而逆轉左室肥厚。本研究表明，異丙腎上腺素誘導的心肌肥厚模型較對照組AT1受體顯著增加，而瑞舒伐他汀組、厄貝沙坦組干預后，AT1受體的mRNA及蛋白表達均顯著低于模型組，提示兩藥具有下調AT1受體轉錄及翻譯水平表達，而聯合組AT1的mRNA及蛋白表達顯著低于單獨用藥組，表明兩藥聯用更有利于改善心肌肥厚，從而證實了我們關于瑞舒伐他汀及厄貝沙坦通過影響AT1受體表達及阻斷血管緊張素II與AT1受體的結合發揮更強及有效抗心肌肥厚作用的假設。

綜上所述，瑞舒伐他汀和厄貝沙坦均能通過下調AT1受體的表達而改善異丙腎上腺素所致的心肌肥厚，兩者聯用較各自單獨應用更有利于改善心肌肥厚，為二者在臨床上聯合用藥治療心肌肥厚、心衰提供新的思路及理論依據。但兩者通過何種機制下調AT1受體的表達，需要進一步更深的研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effect of rosuvastatin combined with irbesartan on remodeling of myocardial hypertrophy in rats

ZHANG Bin, TANG Jian-min, YANG Lei, YANG Yan-hua

(DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China.E-mail:tjmgrx@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To evaluate the effect of rosuvastatin combined with irbesartan on the remodeling of myocardial hypertrophy in the rats. METHODS: Male SD rats (n=50) were randomly divided into control group, model group, rosuvastatin group, irbesartan group and combination group. The model of myocardial hypertrophy was established by subcutaneous injection of isoproterenol at dose of 2.5 mg/kg for 14 d. From the first day of modeling, the rats in control group and model group received intragastrical saline, and the rats in rosuvastatin group, irbesartan group and combination group were treated with rosuvastatin (4 mg·kg-1·d-1), irbesartan (15 mg·kg-1·d-1) and rosuvastatin (4 mg·kg-1·d-1)+ irbesartan (15 mg·kg-1·d-1), respectively. The interventions continued for 4 weeks. After the interventions, the cardiac mass index and left ventricular mass index of the SD rats were measured. Besides, the degree of myocardial hypertrophy was observed with HE staining. The mRNA expression of hypertrophy-related factors, such as ANF, β-MHC and AT1R was determined by RT-PCR, and the protein expression of AT1R was determined by Western blot. RESULTS: Compared with control group, the cardiac mass index, left ventricular mass index, as well as the mRNA expression of ANF and β-MHC in model group were significantly increased (P<0.05). Compared with model group, the above factors in rosuvastatin group and irbesartan group were decreased (P<0.05), and the factors in combination group were lower than those in rosuvastatin group and irbesartan group (P<0.05). In addition, the expression of AT1R at mRNA and protein levels in rosuvastatin group and irbesartan group was lower than that in model group (P<0.05), while the expression AT1R at mRNA and protein levels in combination group was lower than that in rosuvastatin group and irbesartan group (P<0.05). CONCLUSION: Rosuvastatin and irbesartan are equally effective drugs to resist the formation of myocardial hypertrophy by decreasing the expression of AT1R. Moreover, combination of the 2 drugs is more effective to improve the degree of myocardial hypertrophy than the 2 drugs alone.

[KEY WORDS]Cardiac hypertrophy; Rosuvastatin; Irbesartan; AT1 receptor

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.024

[中圖分類號]R363.2

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0371-63974108; E-mail: tjmgrx@163.com

[收稿日期]2015- 10- 13[修回日期] 2016- 01- 12

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0534- 06

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