血紅素加氧酶- 1對(duì)急性肝衰竭大鼠肝組織HMGB1及炎癥的影響

張志恒，李俊生，施曉雷

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京　210009； 2.南京鼓樓醫(yī)院 普外科，江蘇 南京　210008)

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血紅素加氧酶- 1對(duì)急性肝衰竭大鼠肝組織HMGB1及炎癥的影響

張志恒1，李俊生1，施曉雷2

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210009； 2.南京鼓樓醫(yī)院 普外科，江蘇 南京210008)

[摘要]目的：探索血晶素(hemin)誘導(dǎo)血紅素加氧酶- 1(HO- 1)過(guò)表達(dá)對(duì)急性肝衰竭(急性肝衰)大鼠肝臟中高遷移率族蛋白B1(HMGB1)及相關(guān)炎癥因子的影響。方法：將96只SD大鼠按給藥方法不同分成4組，即對(duì)照組、急性肝衰、hemin(HO- 1誘導(dǎo)劑)組、鋅原卟啉(znpp，HO- 1抑制劑)組，每組24只。對(duì)照組腹腔注射生理鹽水；急性肝衰組腹腔注射D- Gal 0.8 g·kg(-1)及LPS 20 μg·kg(-1)制作肝衰竭模型；hemin、znpp組腹腔分別注射hemin 40 μmol·kg(-1)或znpp 50 μmol·kg(-1)，12 h后給予D- Gal和LPS，方法同急性肝衰組。檢測(cè)各組大鼠誘導(dǎo)后24、 72 h肝臟功能變化，比較4組大鼠肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn)。應(yīng)用RT- PCR及Western Blot檢測(cè)肝組織中HO- 1、HMGB1水平，ELISA檢測(cè)TNF- α及IL- 1β濃度；檢測(cè)HO- 1活性。結(jié)果：采用D- Gal和LPS成功建立了大鼠急性肝衰竭模型，與對(duì)照組比較，急性肝衰組谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、IL1β、TNF- α濃度及HMGB1水平均升高(P<0.05)，肝臟組織損傷嚴(yán)重。與急性肝衰組比較：hemin組HO- 1水平及活性上調(diào)，ALT、AST、IL1β、TNF- α濃度(P<0.05)及HMGB1水平顯著降低，肝臟組織損傷緩解；而znpp組HO- 1水平及活性降低， ALT、AST、IL1β、TNF- α濃度(P<0.05)及HMGB1水平升高，肝臟組織損傷加重。結(jié)論：在急性肝衰竭中HMGB1明顯增加，HO- 1的過(guò)表達(dá)可以緩解急性肝衰竭肝臟損傷，其機(jī)制與抑制HMGB1、IL1β、TNF- α的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]高遷移率族蛋白B1； 急性肝衰竭； 血紅素加氧酶- 1； 炎癥

急性肝衰竭(acute liver failure， ALF)是一種以短期肝功能快速丟失為特征的臨床重癥，其預(yù)后差、死亡率高[1]。近年研究表明，炎癥因子及高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein 1， HMGB1)在肝臟急、慢性疾病的不良轉(zhuǎn)歸中扮演重要角色[2]。損傷的肝臟細(xì)胞產(chǎn)生HMGB1，激活巨噬細(xì)胞相關(guān)的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生大量活性介質(zhì)及炎癥因子，進(jìn)而加重?fù)p傷器官中內(nèi)環(huán)境的紊亂導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3]。

血紅素加氧酶- 1(heme oxygenase- 1， HO- 1)是體內(nèi)廣泛存在的一種可誘導(dǎo)酶。研究表明：其具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡的細(xì)胞保護(hù)作用[4]；在腎臟、肝臟、心臟及小腸損傷的模型中，HO- 1直接或間接發(fā)揮了保護(hù)作用，減輕了器官的損傷，其機(jī)制主要為抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞的凋亡[4- 7]；此外在酒精性肝損傷中，使用HO- 1誘導(dǎo)劑血晶素(hemin)或一氧化碳治療后，大鼠肝細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激得到極大的抑制[8]。據(jù)此，本研究對(duì)ALF大鼠HO- 1的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)急性肝衰竭大鼠肝臟中HMGB1及炎癥因子的影響。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與主要試劑

SD雄性大鼠，體重210～240 g，鼠齡7～9周，購(gòu)于南京鼓樓醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。D- Gal、LPS、hemin和鋅原卟啉(znpp，HO- 1抑制劑)及ELISA試劑盒購(gòu)于Sigma公司，抗大鼠HO- 1、actin及HMGB1抗體購(gòu)于Abcam公司，HO- 1活性試劑盒購(gòu)于南京建成科技有限公司，總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司，SYBR GreenTaq購(gòu)于日本TaKaRa公司，引物委托南京威靈生物有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型分組與處理將96只大鼠按照給藥方法分為4組，每組24只。(1)對(duì)照組：腹腔注射等量生理鹽水；(2)ALF組：取D- Gal (0.8 g·kg-1)和LPS (20 μg·kg-1)給SD大鼠腹腔注射構(gòu)建ALF模型；(3)hemin組：ALF造模前12 h腹腔注射hemin(40 μmol·kg-1);(4)znpp組：ALF造模前12 h腹腔注射znpp(50 μmol·kg-1)；在誘導(dǎo)ALF后24、72 h尾靜脈取血，檢測(cè)肝功能及炎癥因子，取肝組織行病理學(xué)檢查。

1.2.2HO- 1及HMGB1 mRNA表達(dá)檢測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)HO- 1、HMGB1 mRNA；采用TRIzol法提取總

RNA。反應(yīng)條件為95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃

延伸12 s；HO- 1上游引物:5- ACCCCACCAAGTTCAAA

CAG- 3；HO- 1下游引物: 5- GAGCAGGAAGGCGGTCTT

AG- 3；HMGB1上游引物：5- CTGGCTTATCCATTGGTGA

TGT- 3； HMGB1下游引物：3- CCTTTAGCTCTGTAGGC

AGCAA- 5；β- actin 上游引物: 5- GCGCTCGTCGTCGAC

AACGG- 3；β- actin 下游引物:5- GTGTGGTGCCAAATCT

TCTCC- 3； 檢測(cè)HO- 1、HMGB1基因的表達(dá)量，用β- actin為參照物，結(jié)果用2-△△Ct表示。

1.2.3HO- 1活性測(cè)定取肝組織置于液氮半小時(shí)后凍存于-80 ℃，使用試劑盒檢測(cè)HO- 1活性，操作方法嚴(yán)格按照其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4Western blot檢測(cè)肝組織HO- 1及HMGB1蛋白取大鼠肝臟制備蛋白樣品，加入SDS- PAGE凝膠電泳緩慢分離后轉(zhuǎn)膜60 min至PVDF膜。5%BSA室溫封閉2 h，加入HO- 1或HMGB1抗體(1︰1 000)，置4 ℃過(guò)夜。TBST洗5遍，置于ECL試劑A和試劑B中孵育5 min，X線片曝光，使用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.2.5血清TNF-α、IL- 1β及肝功能檢測(cè)血清中TNF-α及IL- 1β濃度使用ELISA試劑盒檢驗(yàn)，操作方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；用AU 2700全自動(dòng)生化儀檢測(cè)肝功能。

1.2.6肝臟病理組織學(xué)觀察取新鮮肝臟組織固定于10%福爾馬林液，常規(guī)石蠟包埋，制作5 μm厚切片，使用蘇木精- 伊紅(HE)染色后光鏡下觀察各組肝組織病理學(xué)變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1各組肝功能比較

與對(duì)照組比較，ALF組谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)升高(P<0.05)。與ALF組比較， hemin組ALT、AST明顯下降(P<0.05)；而znpp組ALT、AST顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

U·L-1

與對(duì)照組比較，aP<0.05； 與ALF組比較，bP<0.05

2.2各組肝臟病理學(xué)觀察

對(duì)照組肝臟結(jié)構(gòu)基本無(wú)異常，炎癥反應(yīng)輕微。ALF組可見(jiàn)組織壞死，肝板解離，肝竇正常結(jié)構(gòu)消失，淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。與ALF組比較，hemin組肝臟損傷程度明顯緩解，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少；而znpp組肝臟結(jié)構(gòu)破壞更加嚴(yán)重，伴隨單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1各組肝臟組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)HE染色×200

2.3各組肝內(nèi)HO- 1及HMGB1 mRNA、蛋白水平和HO- 1蛋白活性檢測(cè)

與對(duì)照組比較，ALF組HO- 1、HMGB1 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)。與ALF組比較，hemin組HO- 1 mRNA、蛋白水平及HO- 1活性均顯著升高(P<0.05)，HMGB1 mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05)；而znpp組HO- 1 mRNA和蛋白水平顯著降低，HO- 1活性、HMGB1水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

與對(duì)照組比較，aP<0.05； 與ALF組比較，bP<0.05

A.HO- 1 mRNA表達(dá)量； B.HO- 1活性； C.HMGB1 mRNA表達(dá)量； D.HO- 1和HMGB1蛋白表達(dá)量

2.4各組血清中炎癥因子水平變化見(jiàn)表2。

ng·L-1

與對(duì)照組比較，aP<0.05； 與ALF比較，bP<0.05

與對(duì)照組比較，ALF組血清中TNF-α和IL- 1β的濃度均升高(P<0.05)。與ALF組比較，hemin組TNF-α和IL- 1β的濃度均下降(P<0.05)；而znpp組TNF-α和IL- 1β濃度出現(xiàn)了輕微上升(P<0.05)。

3討論

急性肝衰竭是一種以快速和嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷為特征伴隨著全身炎癥反應(yīng)的臨床重癥[1，9]。固有免疫系統(tǒng)的激活是ALF早期的重要特征之一，其中Kupffer細(xì)胞(KCs)是肝臟固有免疫系統(tǒng)的主要成分之一。Yan 等[10]的研究表明，在ALF的起始階段KCs呈爆發(fā)性的增殖、活化，同時(shí)產(chǎn)生的炎癥因子(如TNF-α和 IL- 1β)對(duì)肝臟進(jìn)行二次損傷。HMGB1是激活KCs的重要介質(zhì)之一，KCs細(xì)胞激活后同樣能釋放大量HMGB1，最終形成一個(gè)惡性循環(huán)。然而，Antoniades等[11]的研究證明，在ALF的后期KCs的促炎活性受到抑制，肝臟功能不斷恢復(fù)，說(shuō)明通過(guò)調(diào)節(jié)KCs可能是干預(yù)ALF的潛在方向之一，HMGB1作為KCs功能的重要參與者需要深入觀察研究。

當(dāng)組織損傷時(shí)，HMGB1可由損傷或壞死的細(xì)胞及活化的免疫細(xì)胞釋放至外周環(huán)境中，通過(guò)激活TLR4或Rage受體，繼而活化NF-κB通路釋放大量促炎因子，同時(shí)趨化中性粒細(xì)胞至損傷部位，最終加重局部組織的損傷[3，12- 13]；說(shuō)明HMGB1水平的升高與不良結(jié)局相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中使用LPS/D- Gal誘導(dǎo)ALF后，與對(duì)照組比較，ALF組肝臟組織出現(xiàn)大量壞死和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，HMGB1水平、血清TNF-α和 IL- 1β的濃度均升高；因此，HMGB1是在ALF中有著重要的地位，通過(guò)調(diào)節(jié)HMGB1水平可能是干預(yù)ALF的潛在方向之一。

HO是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的重要蛋白，廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，有3種同分異構(gòu)體，即HO- 1、HO- 2和HO- 3，其中多種情況可以誘導(dǎo)HO- 1產(chǎn)生，具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)的功能[14]； HO- 1通過(guò)抑制炎癥小體的形成，進(jìn)而抑制 NF-κB 通路的激活，使其下游的IL- 1β濃度下降，最終保護(hù)內(nèi)皮的功能[15]；在胎盤組織中，HO- 1可以通過(guò)擴(kuò)張血管促進(jìn)胎盤血流灌注，對(duì)胎兒起保護(hù)作用[16]；Tao等[17]同樣發(fā)現(xiàn)，HO- 1可以通過(guò)抗炎、抗凋亡及促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，繼而緩解ALF。以上研究說(shuō)明，HO- 1在炎性疾病中具有保護(hù)作用。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ALF組中HO- 1水平出現(xiàn)升高，證實(shí)HO- 1可以在損傷的組織內(nèi)升高，這可能是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制[18]；當(dāng)使用hemin誘導(dǎo)HO- 1后，大鼠ALT、AST出現(xiàn)明顯下降，病理學(xué)顯示HO- 1緩解了肝臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肝細(xì)胞的壞死，同樣HMGB1的水平也被HO- 1抑制，外周血TNF-α和 IL- 1β濃度也出現(xiàn)下降。但是，當(dāng)使用HO- 1抑制劑znpp后，大鼠的HMGB1水平及轉(zhuǎn)氨酶、TNF-α、IL- 1β濃度相對(duì)于ALF組都出現(xiàn)了輕度的回升。

綜上所述,hemin可以減輕D- Gal/LPS誘導(dǎo)的大鼠ALF，其機(jī)制為上調(diào)HO- 1水平及其活性，進(jìn)而抑制HMGB1、IL1β、TNF-α的表達(dá)。

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Effects of HO- 1 on the expression of HMGB1 and inflammatory cytokines in rats with acute liver failure

ZHANG Zhi- heng1，LI Jun- sheng1，SHI Xiao- lei2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China;2.DepartmentofGeneralSurgery，NanjingDrumTowerHospital，Nanjing210008，China)

[Abstract]Objective： To investigate the effects of upregulation of heme oxygenase- 1 with hemin on the expression of liver HMGB1 and associated inflammatory cytokines in rats during acute liver failure. Methods: Ninety six SD rats were divided into 4 groups (n=24) according to the processing conditions: control group， acute liver failure(ALF) group， hemin(HO- 1 inducer) group， znpp(HO- 1 inhibitor) group. Acute liver failure model was induced by intraperitoneally injection of D- Gal (0.8 g·kg(-1))and LPS (20 μg·kg(-1))， control group was given the same volume of saline. Hemin (40 μmol·kg(-1) ) or znpp (50 μmol·kg(-1)) was given intraperitoneally starting from 12 hours before D- Gal and LPS administration. The level of ALT and AST were detected at 24， 72 h after injection and the liver histopathological sections were compared. RT- PCR and Western blot were used to calculate the mRNA and protein levels of HO- 1 or HMGB1 in liver. Serum IL1β and TNF- α concentration were measured by ELISA. HO- 1 activity was detected. ALF model were successfully induced. Results: ALF model were successfully induced by intraperitoneal injection of D- Gal and LPS. Compared with control group， the levels of ALT， AST， IL1β，TNF- α and HMGB1 in ALF group increased significantly(P<0.05)， the structure of liver was damaged severely. Compared with ALF group， hemin treatment markedly increased the levels of HO- 1 and HO- 1 activity which inhibited the levels of ALT， AST， IL1β，TNF- α and HMGB1(P<0.05); While znpp treatment inhibited the levels of HO- 1 and HO- 1 activity thus leading to the up regulation of ALT， AST， IL1β、TNF- α and HMGB1(P<0.05) which aggravated liver damage. Conclusion: The level of HMGB1 is in accordance with the severity of ALF. HO- 1 over- expression could ameliorate the damage of liver. Down- regulated HMGB1， IL1β and TNF- α might be its potential mechanism．

[Key words]high mobility group protein B1; acute liver failure; heme oxygenase- 1; inflammation

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.02.002

[中圖分類號(hào)]R459.7

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671- 6264(2016)02- 0171- 05

[通信作者]施曉雷E- mail：njsxl2000@163.com; 李俊生E- mail:Lijunshenghd@126.com

[作者簡(jiǎn)介]張志恒(1991-)，男，江西撫州人，在讀碩士研究生，E- mail:zhangzhihengfly@163.com

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81170418)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20131084)；江蘇省普通高校研究生實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目基金(SJLX15- 0078)資助項(xiàng)目

[收稿日期]2015- 11- 06[修回日期] 2016- 01- 04

[引文格式] 張志恒，李俊生，施曉雷.血紅素加氧酶- 1對(duì)急性肝衰竭大鼠肝組織HMGB1及炎癥的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2016，35(2)：171- 175.

·論著·