烏司他丁對缺血再灌注大鼠腦保護(hù)及其機(jī)制研究

羅江輝，李文瑤，陶國才

(1.四川省腫瘤醫(yī)院 手術(shù)麻醉科，四川 成都　610041； 2.第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院

手術(shù)麻醉科，重慶　400038)

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烏司他丁對缺血再灌注大鼠腦保護(hù)及其機(jī)制研究

羅江輝1，李文瑤1，陶國才2

(1.四川省腫瘤醫(yī)院 手術(shù)麻醉科，四川 成都610041； 2.第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院

手術(shù)麻醉科，重慶400038)

[摘要]目的：探討烏司他丁對成年SD大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法:將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、假手術(shù)對照組、腦缺血再灌注損傷組、烏司他丁組，每組12只。空白對照組不做手術(shù)處理；假手術(shù)對照組麻醉后僅分離頸總動脈，20 min后縫合切口；腦缺血再灌注組麻醉后建立腦缺血再灌注損傷模型；烏司他丁組在腦缺血再灌注組的基礎(chǔ)上于再灌注時(shí)靜脈注射烏司他丁50μg·kg(-1)。4組大鼠在手術(shù)后6、24、72 h取靜脈血測Sl00β蛋白、神經(jīng)烯醇化酶(NSE)含量。所有大鼠在術(shù)后72 h取血后斷頭處死，取腦組織測IL- 1β、TNF- α含量。結(jié)果:與空白對照組比較，假手術(shù)對照組、腦缺血再灌注組、烏司他丁組術(shù)后6、24、72 h靜脈血Sl00β蛋白、NSE表達(dá)均上升(P<0.01)，術(shù)后72 h腦組織IL- 1β、TNF- α表達(dá)均上升(P<0.01)。與假手術(shù)對照組比較，腦缺血再灌注組術(shù)后6、24、72 h Sl00β蛋白、NSE表達(dá)明顯上升(P<0.01),術(shù)后72 h腦組織IL- 1β、TNF- α表達(dá)均明顯上升(P<0.01)。與腦缺血再灌注組比較，烏司他丁組術(shù)后6、24、72 h Sl00β蛋白、NSE表達(dá)明顯下降(P<0.01)；術(shù)后72 h腦組織 IL- 1β、TNF- α表達(dá)均明顯下降(P<0.01)。結(jié)論:手術(shù)中腦缺血再灌注可導(dǎo)致大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷，引發(fā)大腦炎癥反應(yīng)；烏司他丁可抑制這種損傷，降低大腦炎癥反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]烏司他丁； 神經(jīng)； 缺血再灌注； 炎癥； 大鼠

腦缺血再灌注損傷在臨床手術(shù)中較為常見，對患者預(yù)后及后期生活影響較大，因此降低手術(shù)中腦缺血再灌注損傷是臨床重要課題。在腦缺血再灌注損傷中，主要是炎癥反應(yīng)對神經(jīng)細(xì)胞的損傷。目前研究發(fā)現(xiàn)，烏司他丁具有抗炎和保護(hù)中樞系統(tǒng)作用[1- 2]。本實(shí)驗(yàn)觀察了成年大鼠手術(shù)中缺血再灌注損傷后中樞神經(jīng)損傷及腦炎癥反應(yīng)情況，旨在發(fā)現(xiàn)烏司他丁是否可降低缺血再灌注損傷中炎癥反應(yīng)對神經(jīng)細(xì)胞的損傷。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)動物選用3～4月齡雄性SD大鼠(成都達(dá)碩生物科技有限公司動物實(shí)驗(yàn)中心提供)，隨機(jī)分為空白對照組、假手術(shù)對照組、腦缺血再灌注損傷組、烏司他丁組，每組12只。

1.2模型制備

空白對照組大鼠不做手術(shù)處理，其余3組大鼠使用5%水合氯醛(4～6 ml·kg-1)麻醉，取頸部正中切口，暴露雙側(cè)頸總動脈。假手術(shù)對照組20 min后直接縫合；腦缺血再灌注組、烏司他丁組分別用兩只無創(chuàng)微血管夾同時(shí)夾閉雙側(cè)頸總動脈，20 min后同時(shí)松開血

管夾，觀察到雙側(cè)頸總動脈復(fù)流后縫合[3]。烏司他丁組于復(fù)流后立即靜脈注射鹽酸烏司他丁50μg·kg-1。有呼吸困難、提前死亡及處死時(shí)發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血的動物均棄之不用。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1血漿SlOOβ蛋白、神經(jīng)烯醇化酶(NSE)含量檢測各組大鼠于術(shù)后6、24、72 h采用尾靜脈采靜脈血漿，使用Sl00β蛋白、NSE試劑盒檢測，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。

1.3.2腦組織 IL- 1β、TNF-α含量檢測各組大鼠于72 h取血后斷頭處死取腦，將全腦勻漿，使用ELISA試劑盒檢測腦組織IL- 1β、TNF-α含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1各組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)S100β、NSE檢測見表1。

ng·L-1

與空白對照組比較，aP<0.01；與假手術(shù)對照組比較，bP<0.01；與腦缺血再灌注組比較，cP<0.01

術(shù)后6、24、72 h，假手術(shù)對照組、缺血再灌注組、烏司他丁組血漿S100β蛋白、NSE表達(dá)均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。腦缺血再灌注組血漿S100β蛋白、NSE表達(dá)均高于假手術(shù)對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。烏司他丁組血漿S100β蛋白、NSE表達(dá)均低于腦缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2各組大鼠術(shù)后72 h大腦炎癥因子表達(dá)見表2。

ng·L-1

與空白對照組比較，aP<0.01；與假手術(shù)對照組比較，bP<0.01；與腦缺血再灌注組比較，cP<0.01

術(shù)后72 h，假手術(shù)對照組、缺血再灌注組、烏司他丁組大鼠腦組織TNF-α和IL- 1β表達(dá)均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。腦缺血再灌注組腦組織TNF-α和IL- 1β表達(dá)較假手術(shù)對照組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；烏司他丁組大鼠腦組織TNF-α和IL- 1β表達(dá)低于腦缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3討論

腦缺血再灌注損傷在臨床較為常見，一旦發(fā)生可引起神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡，對患者傷害較大[4]。S100β蛋白、NSE是目前常用的檢測腦損傷及腦功能損傷指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，手術(shù)后6、24、72 h，假手術(shù)對照組與缺血再灌注組NSE和Sl00β蛋白表達(dá)均上升，而缺血再灌注組明顯高于假手術(shù)組，說明缺血再灌注較單純手術(shù)對神經(jīng)細(xì)胞損傷更大。

腦缺血再灌注損傷機(jī)制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)在其中發(fā)揮了重要作用[5]。TNF-α和IL- 1β是兩個(gè)重要的炎癥細(xì)胞因子，在腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)中起重要作用[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，手術(shù)后72 h，沒有發(fā)生腦缺血再灌注損傷的大鼠腦組織炎癥反應(yīng)較輕，而發(fā)生腦缺血再灌注損傷的大鼠腦組織炎癥反應(yīng)較重，說明缺血再灌注較手術(shù)本身引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)更強(qiáng)。目前研究認(rèn)為，手術(shù)本身即可引起一定程度神經(jīng)損傷，也是造成術(shù)后認(rèn)知功能障礙的重要原因，而術(shù)中發(fā)生缺血再灌注則可引起嚴(yán)重神經(jīng)損傷。本研究與文獻(xiàn)相符。

烏司他丁的中樞保護(hù)作用已有研究[1- 2]證實(shí)。研究[6- 7]發(fā)現(xiàn)，烏司他丁能抑制氧自由基的產(chǎn)生，阻抑內(nèi)源性休克因子如心肌頓抑因子(myocardial depressant factor，MDF)生成，抑制多種炎癥介質(zhì)如TNF-α、血小板活化因子(PAF)、白介素(IL- 6、IL- 8)等產(chǎn)生。推測烏司他丁的腦保護(hù)作用與其抗炎作用密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，使用烏司他丁可減少手術(shù)引起的中樞炎癥反應(yīng)，同時(shí)降低缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷，故推測烏司他丁可在缺血再灌注損傷中通過減輕炎癥反應(yīng)降低神經(jīng)細(xì)胞損傷。

綜上所述，腦缺血再灌注損傷可大鼠引發(fā)大腦炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致大腦神經(jīng)損傷。使用烏司他丁可抑制這種損傷，降低大腦神經(jīng)細(xì)胞損傷。

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Protective effect and mechanism of ulinastatin on brain ischemic reperfusion injury in rats

LUO Jiang- hui1，LI Wen- yao1，TAO Guo- cai2

(1.DepartmentofSurgeryandAnesthesiology，SichuanCancerHospital，Chengdu610041，China； 2.DepartmentofSurgeryandAnesthesiology，SouthwestHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038，China)

[Abstract]Objective： To investigate the protective effect and the mechanism of ulinastatin on the brain ischemic- reperfusion injury in rats. Methods: Male Sprague- Dawley adult rats were randomly allocated to control group，surgery alone group，ischemic- reperfusion brain injury group，and ulinastatin group. Rats in surgery alone group received surgery without ischemic- reperfusion. Rats in ischemic- reperfusion brain surgery group received ischemic- reperfusion brain surgery. Rats in ulinastatin group received intravenous injection of ulinastatin(50μg·kg(-1))at the time after ischemic- reperfusion brain injury. The concentrations of S100β and NSE in plasma were measured by ELISA at 6，24，72 h after operation. Brain IL- 1β and TNF- α were measured by ELISA at 72 h after operation. Results: Compared with control group，the expression of S100β and NSE were enhanced in the surgery alone group，ischemic- reperfusion brain injury group and ulinastatin group at 6,24,72 h after operation (P<0.01)，and brain expression of IL- 1β and TNF- α were enhanced at 72 h after operation(P<0.01). Compared with injury alone group，the expression of S100β and NSE were enhanced in ischemic- reperfusion brain surgery group and ulinastatin group at 6,24,72 h after operation (P<0.01)and brain expression of IL- 1β，TNF- α were enhanced at 72 h after operation(P<0.01). Compared with ischemic- reperfusion brain injury group，the expression of S100β and NSE were diminished at 6,24,72 h after operation(P<0.01)and the expression of IL- 1β and TNF- α were diminished at 72 h after operation in ulinastatin group(P<0.01). Conclusion: Ulinastatin can restrain inflammation in central nervous system and diminish the nervous impairment after ischemic- reperfusion brain injury in rats．

[Key words]ulinastatin; nerve; ischemic- reperfusion; inflammation; rat

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.02.010

[中圖分類號]R453.9

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)02- 0199- 03

[通信作者]陶國才E- mail:13908393339@vip.163.com

[作者簡介]羅江輝(1972-)，男，四川瀘州人，主治醫(yī)師。E- mail：temasek@qq.com

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(81171034)

[收稿日期]2015- 06- 11[修回日期] 2015- 12- 23

[引文格式] 羅江輝，李文瑤，陶國才.烏司他丁對缺血再灌注大鼠腦保護(hù)及其機(jī)制研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2016，35(2)：199- 201.

·論著·