雙抗體夾心ELISA法研究rMBP- NAP在大鼠體內的藥代動力學

崔明辰，陳嬌，時冉冉，王建國

(漯河醫學高等專科學校 1.醫療系, 2.生物化學教研室，河南 漯河　462002)

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雙抗體夾心ELISA法研究rMBP- NAP在大鼠體內的藥代動力學

崔明辰1，陳嬌2，時冉冉2，王建國

(漯河醫學高等專科學校 1.醫療系, 2.生物化學教研室，河南 漯河462002)

[摘要]目的:研究重組麥芽糖結合蛋白- 中性粒細胞激活蛋白(rMBP- NAP )在大鼠體內的藥代動力學。方法:給大鼠靜脈注射rMBP- NAP后在不同時間點采血，用雙抗體夾心酶聯免疫法(ELISA)測定rMBP- NAP的血漿濃度，然后用DAS2.1藥動學軟件進行曲線擬合并計算藥代動力學參數。結果:rMBP- NAP靜脈給藥后迅速入血，2.5、5和10 mg·kg(-1) 3種劑量的消除半衰期分別為1.983、1.747和2.006 h，血漿清除率呈非劑量依賴性改變，血漿藥物濃度—時間曲線下面積隨著劑量的增加而成比例增加；rMBP- NAP在大鼠體內的分布以腎臟最高，其后為肺和肝，以腦組織中濃度最低。結論:rMBP- NAP給藥后能迅速進入血液循環，其消除符合線性動力學特征，rMBP- NAP在大鼠體內的藥代動力學過程符合二室開放模型，呈一級動力學消除，給藥后主要分布到腎臟。

[關鍵詞]rMBP- NAP； 酶聯免疫法； 藥代動力學

在腫瘤宿主抗原特異性T細胞的分化過程中，Th2的分化占優勢，Th2優勢狀態與腫瘤的免疫逃逸有密切關系[1- 3]。幽門螺桿菌中性粒細胞激活蛋白(HP- NAP)是幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.Pylori)的主要毒力因子之一。Amedei等報道，HP- NAP是一種脫氧受體2(Toll- like receptor 2)激動劑，能夠誘導人中性粒細胞和單核細胞產生IL- 12和IL- 23等細胞因子，促進樹狀突細胞(DC)成熟，使宿主抗原特異性CD4+T細胞由Th2向Th1免疫反應轉變，產生顯著的細胞毒性免疫應答[4]，增強Th1免疫，起到對腫瘤進行免疫治療的作用。

但是由于H.Pylori體外培養條件苛刻，利用DNA重組技術制備HP- NAP技術成熟且有市場開發價值。我們從H.Pylori臨床分離株MEL- HP27中克隆到HP- NAP編碼基因HP- napA全長，目前，已經通過基因工程手段對天然序列改造，獲得了一組新型重組融合蛋白，經篩選重組麥芽糖結合蛋白-中性粒細胞激活蛋白(recombinant maltose- binding protein- neutrophil- activa-

ting protein， rMBP- NAP )具有免疫活性[5]。

目前，尚未有關于rMBP- NAP藥代動力學的報道，為了確立rMBP- NAP的藥代動力學特性以及其藥代藥效間的關系，本實驗欲建立一種雙抗體夾心酶聯免疫法(ELISA)，測定融合蛋白rMBP- NAP在對大鼠給藥后的藥代動力學，以了解其代謝情況，為合理用藥提供依據。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

rMBP- NAP[6]、重組谷胱甘肽- 中性粒細胞激活蛋白(GST- NAP)均由本實驗室制備，濃度為2 mg·ml-1，純度96.5%。兔抗NAP多克隆抗體由本實驗室制備，濃度為2.5 mg·ml-1，純度97%；MBP- 標簽小鼠單克隆抗體(南京金斯瑞生物科技公司)；Bio Rad 680酶標儀(上海麥莎生物科技有限公司)；Heal Force Neofuge 15R 臺式高速冷凍離心機。

1.2動物

清潔級SD大鼠，6～8周齡，雌雄各半，河南省實驗動物中心提供，動物合格證號SYXK(豫)2005- 0012。

1.3棋盤滴定法確定抗體夾心ELISA最佳試劑濃度

將捕獲抗體(兔NAP多克隆抗體2.5 mg·ml-1)分別稀釋成濃度為1︰500、1︰1 000、1︰2 000，包被在ELISA酶標板上，每一濃度包被一橫行，4 ℃過夜，洗滌拍干；把強陽性抗原(125 ng·ml-1)與陰性對照液加到同一包被抗體濃度的一列中，溫育，洗滌拍干。抗體稀釋液將檢測抗體(小鼠MBP標簽單抗0.5 mg·ml-1)分別稀釋成濃度為1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000，加到每一縱行，溫育，洗滌拍干；每孔加入1∶25 000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體，溫育，洗滌拍干顯色，讀取OD450值。

1.4大鼠血漿中rMBP- NAP檢測標準曲線的制備

應用建立的最佳ELISA條件測定不同稀釋倍數的rMBP- NAP蛋白(1000、500、250、125、62.5、31.25和15.625 ng·ml-1)，用Origin 8.0軟件中的四參數邏輯曲線繪制標準曲線，求得回歸方程。

1.5大鼠血漿中rMBP- NAP回收率測定

將大鼠空白血漿配制成含250、62.5、15.625 ng·ml-1的rMBP- NAP，每個樣品設6個孔，按夾心ELISA步驟檢測，計算出平均回收率。

1.6ELISA法的靈敏度、精密度及特異性

在線性范圍內選取選取250、62.5、15.625 ng·ml-13個濃度，與標準曲線同時測定。在同一次實驗中每個濃度測6孔，計算批內變異系數；連續測6批，計算批間變異系數。

將rMBP- NAP的結構相似物GST- NAP及標準品rMBP- NAP以相同的終濃度加入到rMBP- NAP中。具體如下:設6個樣本孔，加入100 μl rMBP- NAP(終濃度為62.5 ng·ml-1)，另設6個對照孔，加入終體積為100 μl 的rMBP- NAP(終濃度為62.5 ng·ml-1)和GST- NAP(終濃度為也62.5 ng·ml-1)，觀察干擾物對rMBP- NAP的測定影響。

1.7rMBP- NAP在大鼠體內的藥代動力學研究

選取24只SD大鼠，雌雄各半，隨機分成4組，每組6只，參照藥效學試驗，將rMBP- NAP劑量設為10、5、2.5 mg·kg-1)，另設空白對照組，尾靜脈注射給藥體積1 ml。給藥后0.25、0.5、1、2、 4、6、 8、10 和12 h 從眼眶靜脈叢用肝素化的毛細管采血，離心收集血漿，低溫保存，待樣品準備完后按照優化過的雙抗體夾心ELISA方法檢測。然后用DAS2.2.1藥動學軟件進行曲線擬合并計算參數。

1.8rMBP- NAP靜脈注射后在大鼠體內的組織分布檢測

選取24只大鼠，雌雄各半，隨機分成4組，每組6只，其中1組為空白對照組，其余3組按照5 mg·kg-1劑量尾靜脈注射給藥，體積為1 ml。分別在給藥后0.5、2、4 h將大鼠乙醚麻醉處死，迅速取出心、肝、脾、肺、腎以及腦組織，用預冷的PBS沖凈組織血液，濾紙吸干后稱重，剪碎組織后加入組織重量5倍體積的預冷PBS，用高速勻漿器制成勻漿，以3 000 r·min-1離心10 min后取上清，用PBS稀釋不同倍數制成樣品，用建立的ELISA法完成測定。

2結果

2.1雙抗體夾心ELISA法的建立

棋盤滴定結果顯示，兔NAP多克隆抗體滴定濃度為1∶500，小鼠MBP單克隆抗體滴定濃度為1∶1 000處的OD450值在0.8左右，陰性對照的OD450小于0.1，因此，這兩種抗體的稀釋度選擇1∶500和1∶1 000。

2.2雙抗體夾心ELISA法標準曲線

雙抗體夾心ELISA法標準曲線如圖1，標準曲線范圍5.625～1 000 ng·ml-1，R2>0.99。

圖1雙抗體夾心ELISA方法檢測重組融合蛋白rMBP- NAP標準曲線

2.3雙抗體夾心ELISA法檢測rMBP- NAP的回收率

測得 rMBP- NAP在250、62.5、15.625 ng·ml-13種濃度時的回收率見表1， 平均回收率為106%。

表1ELISA法檢測rMBP- NAP的回收率

樣品序號理論值/ng·ml-1平均值/ng·ml-1標準差SD回收率/%1250260.7315.39104262.564.154.96103315.62517.281.25111

2.4ELISA法檢測rMBP- NAP的靈敏度、精密度及特異性

經多次測定， ELISA法最低檢測靈敏度為15.625 ng·ml-1。批內及批間變異系數如表2所示，均小于10%，符合精密度的要求。

在加入了結構類似物GST- NAP后，OD450檢測值變化很小，與未加結構類似物相比，差異無統計學意義，說明此ELISA方法能特異性檢測rMBP- NAP。

表2ELISA法檢測rMBP- NAP的批內及批間精密度

理論值/ng·ml-1測定平均值/ng·ml-1標準差SD變異系數CV/%平均變異系數CV/%批內6.95250260.7315.395.9062.564.154.967.7315.6317.281.257.23批間6.93250257.2217.336.7362.564.804.026.2015.6316.391.297.85

表3ELISA法測定rMBP- NAP的特異性

樣品孔1OD值孔2OD值孔3OD值孔4OD值孔5OD值孔6OD值平均OD值P值rMBP-NAP61.25ng·ml-10.6070.5480.5350.4560.5380.5360.537加入等濃度GST-NAP0.540.5290.480.510.490.460.500.84

2.5rMBP- NAP靜脈給藥后大鼠血藥濃度及藥代動力學參數的變化

圖2顯示，靜脈注射rMBP- NAP后迅速入血，然后慢慢消除，12 h時在血液中仍能被檢測到，藥代動力學參數如表4。

圖2靜脈注射給藥后大鼠血漿中rMBP- NAP的血藥濃度—時間曲線(n=6)

2.6雙抗體夾心ELISA法檢測大鼠靜脈注射融合蛋白rMBP- NAP在組織器官分布

如圖3，可見rMBP- NAP進入體內大鼠后，主要分布到腎臟，其次為肝臟。

3討論

目前臨床多使用一種或幾種細胞因子來改變T細胞向Th1/Th2漂移，如使用IL- 2、IFN-γ或拮抗劑等[7]。但細胞因子網絡復雜，有時單一細胞因子療效不顯著，調節不當甚至有副作用[8]。初步藥效學實驗表明，重組rMBP- NAP具有提高Th1免疫活性的作用，可開發成為有效的細胞免疫調節劑。

我們采用雙抗體夾心ELISA法測定了大鼠血漿中rMBP- NAP的含量，結果表明此方法特異性高、回收率穩定、靈敏度及精密度良好，能夠滿足測定要求。

本研究結果顯示，2.5、5、10 mg·kg-1rMBP- NAP靜脈注射后的消除半衰期和血漿清除率呈非劑量依賴性改變，血藥濃度—時間曲線下面積和劑量均呈線性關系，藥物峰濃度與給藥劑量基本呈正相關，提示rMBP- NAP藥物消除符合線性動力學特征，在大鼠的體內過程呈一級消除動力學。予以大鼠5 mg·kg-1rMBP- NAP靜脈注射后顯示，在腎臟中分布最高，其次為肝臟和肺，在腦組織中濃度最低。該結果也基本反映了rMBP- NAP主要分布到腎臟并由尿排泄的消除途徑。

表4大鼠靜脈注射rMBP- NAP后的藥代動力學參數

rMBP-NAP劑量藥代動力學參數藥-時曲線下面積/μg·h-1·L-1峰濃度/μg·L-1達峰時間/h半衰期/h2.5mg·kg-1252526.74±18956.979103803.67±3121.2950.251.983±0.4115mg·kg-1625904.66±70638.334229033.333±15100.9490.251.747±0.53610mg·kg-11444486.86±205120.287393333.333±22240.0240.252.006±0.31rMBP-NAP劑量藥代動力學參數平均駐留時間/h血漿清除率/L·h-1·g-1表觀分布容積/L·kg-12.5mg·kg-12.225±0.20.01±0.0010.015±0.0045mg·kg-12.653±0.3140.008±0.0010.02±0.00610mg·kg-12.979±0.3430.007±0.0010.02±0.004

圖3靜脈注射rMBP- NAP后的組織器官分布

總之，rMBP- NAP的藥代動力學研究是新藥藥理評價的重要內容之一，它在一定程度上揭示了rMBP- NAP在體內的動態過程，為臨床合理用藥提供了部分理論依據。

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doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.02.017

[中圖分類號]R969.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)02- 0222- 04

[通信作者]王建國ranranpeptide@163.com

[作者簡介]崔明辰(1964-)，男，河南南陽人，副主任醫師，醫學碩士。E- mail:ajiao278747551@126.com

[基金項目]漯河醫學高等專科學校科研基金(2014- S- LMC10)

[收稿日期]2015- 10- 14[修回日期] 2015- 12- 22

[引文格式] 崔明辰，陳嬌，時冉冉，等.雙抗體夾心ELISA法研究rMBP- NAP在大鼠體內的藥代動力學[J].東南大學學報:醫學版，2016，35(2):222- 225.

·論著·