雙抗體夾心ELISA法研究rMBP- NAP在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)

崔明辰，陳嬌，時(shí)冉冉，王建國(guó)

(漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 1.醫(yī)療系, 2.生物化學(xué)教研室，河南 漯河　462002)

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雙抗體夾心ELISA法研究rMBP- NAP在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)

崔明辰1，陳嬌2，時(shí)冉冉2，王建國(guó)

(漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 1.醫(yī)療系, 2.生物化學(xué)教研室，河南 漯河462002)

[摘要]目的:研究重組麥芽糖結(jié)合蛋白- 中性粒細(xì)胞激活蛋白(rMBP- NAP )在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。方法:給大鼠靜脈注射rMBP- NAP后在不同時(shí)間點(diǎn)采血，用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定rMBP- NAP的血漿濃度，然后用DAS2.1藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行曲線(xiàn)擬合并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果:rMBP- NAP靜脈給藥后迅速入血，2.5、5和10 mg·kg(-1) 3種劑量的消除半衰期分別為1.983、1.747和2.006 h，血漿清除率呈非劑量依賴(lài)性改變，血漿藥物濃度—時(shí)間曲線(xiàn)下面積隨著劑量的增加而成比例增加；rMBP- NAP在大鼠體內(nèi)的分布以腎臟最高，其后為肺和肝，以腦組織中濃度最低。結(jié)論:rMBP- NAP給藥后能迅速進(jìn)入血液循環(huán)，其消除符合線(xiàn)性動(dòng)力學(xué)特征，rMBP- NAP在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程符合二室開(kāi)放模型，呈一級(jí)動(dòng)力學(xué)消除，給藥后主要分布到腎臟。

[關(guān)鍵詞]rMBP- NAP； 酶聯(lián)免疫法； 藥代動(dòng)力學(xué)

在腫瘤宿主抗原特異性T細(xì)胞的分化過(guò)程中，Th2的分化占優(yōu)勢(shì)，Th2優(yōu)勢(shì)狀態(tài)與腫瘤的免疫逃逸有密切關(guān)系[1- 3]。幽門(mén)螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(HP- NAP)是幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori，H.Pylori)的主要毒力因子之一。Amedei等報(bào)道，HP- NAP是一種脫氧受體2(Toll- like receptor 2)激動(dòng)劑，能夠誘導(dǎo)人中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生IL- 12和IL- 23等細(xì)胞因子，促進(jìn)樹(shù)狀突細(xì)胞(DC)成熟，使宿主抗原特異性CD4+T細(xì)胞由Th2向Th1免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答[4]，增強(qiáng)Th1免疫，起到對(duì)腫瘤進(jìn)行免疫治療的作用。

但是由于H.Pylori體外培養(yǎng)條件苛刻，利用DNA重組技術(shù)制備HP- NAP技術(shù)成熟且有市場(chǎng)開(kāi)發(fā)價(jià)值。我們從H.Pylori臨床分離株MEL- HP27中克隆到HP- NAP編碼基因HP- napA全長(zhǎng)，目前，已經(jīng)通過(guò)基因工程手段對(duì)天然序列改造，獲得了一組新型重組融合蛋白，經(jīng)篩選重組麥芽糖結(jié)合蛋白-中性粒細(xì)胞激活蛋白(recombinant maltose- binding protein- neutrophil- activa-

ting protein， rMBP- NAP )具有免疫活性[5]。

目前，尚未有關(guān)于rMBP- NAP藥代動(dòng)力學(xué)的報(bào)道，為了確立rMBP- NAP的藥代動(dòng)力學(xué)特性以及其藥代藥效間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)欲建立一種雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)，測(cè)定融合蛋白rMBP- NAP在對(duì)大鼠給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)，以了解其代謝情況，為合理用藥提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

rMBP- NAP[6]、重組谷胱甘肽- 中性粒細(xì)胞激活蛋白(GST- NAP)均由本實(shí)驗(yàn)室制備，濃度為2 mg·ml-1，純度96.5%。兔抗NAP多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備，濃度為2.5 mg·ml-1，純度97%；MBP- 標(biāo)簽小鼠單克隆抗體(南京金斯瑞生物科技公司)；Bio Rad 680酶標(biāo)儀(上海麥莎生物科技有限公司)；Heal Force Neofuge 15R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)。

1.2動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，6～8周齡，雌雄各半，河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SYXK(豫)2005- 0012。

1.3棋盤(pán)滴定法確定抗體夾心ELISA最佳試劑濃度

將捕獲抗體(兔NAP多克隆抗體2.5 mg·ml-1)分別稀釋成濃度為1︰500、1︰1 000、1︰2 000，包被在ELISA酶標(biāo)板上，每一濃度包被一橫行，4 ℃過(guò)夜，洗滌拍干；把強(qiáng)陽(yáng)性抗原(125 ng·ml-1)與陰性對(duì)照液加到同一包被抗體濃度的一列中，溫育，洗滌拍干。抗體稀釋液將檢測(cè)抗體(小鼠MBP標(biāo)簽單抗0.5 mg·ml-1)分別稀釋成濃度為1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000，加到每一縱行，溫育，洗滌拍干；每孔加入1∶25 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，溫育，洗滌拍干顯色，讀取OD450值。

1.4大鼠血漿中rMBP- NAP檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

應(yīng)用建立的最佳ELISA條件測(cè)定不同稀釋倍數(shù)的rMBP- NAP蛋白(1000、500、250、125、62.5、31.25和15.625 ng·ml-1)，用Origin 8.0軟件中的四參數(shù)邏輯曲線(xiàn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得回歸方程。

1.5大鼠血漿中rMBP- NAP回收率測(cè)定

將大鼠空白血漿配制成含250、62.5、15.625 ng·ml-1的rMBP- NAP，每個(gè)樣品設(shè)6個(gè)孔，按夾心ELISA步驟檢測(cè)，計(jì)算出平均回收率。

1.6ELISA法的靈敏度、精密度及特異性

在線(xiàn)性范圍內(nèi)選取選取250、62.5、15.625 ng·ml-13個(gè)濃度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)同時(shí)測(cè)定。在同一次實(shí)驗(yàn)中每個(gè)濃度測(cè)6孔，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)；連續(xù)測(cè)6批，計(jì)算批間變異系數(shù)。

將rMBP- NAP的結(jié)構(gòu)相似物GST- NAP及標(biāo)準(zhǔn)品rMBP- NAP以相同的終濃度加入到rMBP- NAP中。具體如下:設(shè)6個(gè)樣本孔，加入100 μl rMBP- NAP(終濃度為62.5 ng·ml-1)，另設(shè)6個(gè)對(duì)照孔，加入終體積為100 μl 的rMBP- NAP(終濃度為62.5 ng·ml-1)和GST- NAP(終濃度為也62.5 ng·ml-1)，觀察干擾物對(duì)rMBP- NAP的測(cè)定影響。

1.7rMBP- NAP在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

選取24只SD大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，每組6只，參照藥效學(xué)試驗(yàn)，將rMBP- NAP劑量設(shè)為10、5、2.5 mg·kg-1)，另設(shè)空白對(duì)照組，尾靜脈注射給藥體積1 ml。給藥后0.25、0.5、1、2、 4、6、 8、10 和12 h 從眼眶靜脈叢用肝素化的毛細(xì)管采血，離心收集血漿，低溫保存，待樣品準(zhǔn)備完后按照優(yōu)化過(guò)的雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)。然后用DAS2.2.1藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行曲線(xiàn)擬合并計(jì)算參數(shù)。

1.8rMBP- NAP靜脈注射后在大鼠體內(nèi)的組織分布檢測(cè)

選取24只大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，每組6只，其中1組為空白對(duì)照組，其余3組按照5 mg·kg-1劑量尾靜脈注射給藥，體積為1 ml。分別在給藥后0.5、2、4 h將大鼠乙醚麻醉處死，迅速取出心、肝、脾、肺、腎以及腦組織，用預(yù)冷的PBS沖凈組織血液，濾紙吸干后稱(chēng)重，剪碎組織后加入組織重量5倍體積的預(yù)冷PBS，用高速勻漿器制成勻漿，以3 000 r·min-1離心10 min后取上清，用PBS稀釋不同倍數(shù)制成樣品，用建立的ELISA法完成測(cè)定。

2結(jié)果

2.1雙抗體夾心ELISA法的建立

棋盤(pán)滴定結(jié)果顯示，兔NAP多克隆抗體滴定濃度為1∶500，小鼠MBP單克隆抗體滴定濃度為1∶1 000處的OD450值在0.8左右，陰性對(duì)照的OD450小于0.1，因此，這兩種抗體的稀釋度選擇1∶500和1∶1 000。

2.2雙抗體夾心ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

雙抗體夾心ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍5.625～1 000 ng·ml-1，R2>0.99。

圖1雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)重組融合蛋白rMBP- NAP標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.3雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)rMBP- NAP的回收率

測(cè)得 rMBP- NAP在250、62.5、15.625 ng·ml-13種濃度時(shí)的回收率見(jiàn)表1， 平均回收率為106%。

表1ELISA法檢測(cè)rMBP- NAP的回收率

樣品序號(hào)理論值/ng·ml-1平均值/ng·ml-1標(biāo)準(zhǔn)差SD回收率/%1250260.7315.39104262.564.154.96103315.62517.281.25111

2.4ELISA法檢測(cè)rMBP- NAP的靈敏度、精密度及特異性

經(jīng)多次測(cè)定， ELISA法最低檢測(cè)靈敏度為15.625 ng·ml-1。批內(nèi)及批間變異系數(shù)如表2所示，均小于10%，符合精密度的要求。

在加入了結(jié)構(gòu)類(lèi)似物GST- NAP后，OD450檢測(cè)值變化很小，與未加結(jié)構(gòu)類(lèi)似物相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明此ELISA方法能特異性檢測(cè)rMBP- NAP。

表2ELISA法檢測(cè)rMBP- NAP的批內(nèi)及批間精密度

理論值/ng·ml-1測(cè)定平均值/ng·ml-1標(biāo)準(zhǔn)差SD變異系數(shù)CV/%平均變異系數(shù)CV/%批內(nèi)6.95250260.7315.395.9062.564.154.967.7315.6317.281.257.23批間6.93250257.2217.336.7362.564.804.026.2015.6316.391.297.85

表3ELISA法測(cè)定rMBP- NAP的特異性

樣品孔1OD值孔2OD值孔3OD值孔4OD值孔5OD值孔6OD值平均OD值P值rMBP-NAP61.25ng·ml-10.6070.5480.5350.4560.5380.5360.537加入等濃度GST-NAP0.540.5290.480.510.490.460.500.84

2.5rMBP- NAP靜脈給藥后大鼠血藥濃度及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化

圖2顯示，靜脈注射rMBP- NAP后迅速入血，然后慢慢消除，12 h時(shí)在血液中仍能被檢測(cè)到，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表4。

圖2靜脈注射給藥后大鼠血漿中rMBP- NAP的血藥濃度—時(shí)間曲線(xiàn)(n=6)

2.6雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)大鼠靜脈注射融合蛋白rMBP- NAP在組織器官分布

如圖3，可見(jiàn)rMBP- NAP進(jìn)入體內(nèi)大鼠后，主要分布到腎臟，其次為肝臟。

3討論

目前臨床多使用一種或幾種細(xì)胞因子來(lái)改變T細(xì)胞向Th1/Th2漂移，如使用IL- 2、IFN-γ或拮抗劑等[7]。但細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，有時(shí)單一細(xì)胞因子療效不顯著，調(diào)節(jié)不當(dāng)甚至有副作用[8]。初步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，重組rMBP- NAP具有提高Th1免疫活性的作用，可開(kāi)發(fā)成為有效的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)劑。

我們采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定了大鼠血漿中rMBP- NAP的含量，結(jié)果表明此方法特異性高、回收率穩(wěn)定、靈敏度及精密度良好，能夠滿(mǎn)足測(cè)定要求。

本研究結(jié)果顯示，2.5、5、10 mg·kg-1rMBP- NAP靜脈注射后的消除半衰期和血漿清除率呈非劑量依賴(lài)性改變，血藥濃度—時(shí)間曲線(xiàn)下面積和劑量均呈線(xiàn)性關(guān)系，藥物峰濃度與給藥劑量基本呈正相關(guān)，提示rMBP- NAP藥物消除符合線(xiàn)性動(dòng)力學(xué)特征，在大鼠的體內(nèi)過(guò)程呈一級(jí)消除動(dòng)力學(xué)。予以大鼠5 mg·kg-1rMBP- NAP靜脈注射后顯示，在腎臟中分布最高，其次為肝臟和肺，在腦組織中濃度最低。該結(jié)果也基本反映了rMBP- NAP主要分布到腎臟并由尿排泄的消除途徑。

表4大鼠靜脈注射rMBP- NAP后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

rMBP-NAP劑量藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)藥-時(shí)曲線(xiàn)下面積/μg·h-1·L-1峰濃度/μg·L-1達(dá)峰時(shí)間/h半衰期/h2.5mg·kg-1252526.74±18956.979103803.67±3121.2950.251.983±0.4115mg·kg-1625904.66±70638.334229033.333±15100.9490.251.747±0.53610mg·kg-11444486.86±205120.287393333.333±22240.0240.252.006±0.31rMBP-NAP劑量藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)平均駐留時(shí)間/h血漿清除率/L·h-1·g-1表觀分布容積/L·kg-12.5mg·kg-12.225±0.20.01±0.0010.015±0.0045mg·kg-12.653±0.3140.008±0.0010.02±0.00610mg·kg-12.979±0.3430.007±0.0010.02±0.004

圖3靜脈注射rMBP- NAP后的組織器官分布

總之，rMBP- NAP的藥代動(dòng)力學(xué)研究是新藥藥理評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容之一，它在一定程度上揭示了rMBP- NAP在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，為臨床合理用藥提供了部分理論依據(jù)。

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doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.02.017

[中圖分類(lèi)號(hào)]R969.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671- 6264(2016)02- 0222- 04

[通信作者]王建國(guó)ranranpeptide@163.com

[作者簡(jiǎn)介]崔明辰(1964-)，男，河南南陽(yáng)人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。E- mail:ajiao278747551@126.com

[基金項(xiàng)目]漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校科研基金(2014- S- LMC10)

[收稿日期]2015- 10- 14[修回日期] 2015- 12- 22

[引文格式] 崔明辰，陳嬌，時(shí)冉冉，等.雙抗體夾心ELISA法研究rMBP- NAP在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2016，35(2):222- 225.

·論著·