子宮內(nèi)膜異位組織中VEGF、c-fos表達(dá)及意義

潘虹，刁靜，湯蘊(yùn)琦，潘穎琳，李佳蕊，張萍(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海200092)

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子宮內(nèi)膜異位組織中VEGF、c-fos表達(dá)及意義

潘虹，刁靜，湯蘊(yùn)琦，潘穎琳，李佳蕊，張萍(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海200092)

摘要：目的探討子宮內(nèi)膜異位組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、c-fos表達(dá)及意義。方法選擇23例子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)患者異位內(nèi)膜組織23例份(異位內(nèi)膜組)及在位內(nèi)膜組織20例份(在位內(nèi)膜組)，正常子宮內(nèi)膜組織21例份(對照組)。采用免疫組化SP法檢測各組VEGF表達(dá)，蛋白免疫印跡法檢測各組c-fos表達(dá)，并分析內(nèi)膜組織VEGF與c-fos蛋白表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組VEGF、c-fos表達(dá)均高于對照組，P均<0.05；異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組VEGF、c-fos表達(dá)比較，P均>0.05。子宮內(nèi)膜組織中VEGF與c-fos表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.425，P<0.05)。結(jié)論EMs患者在位及異位內(nèi)膜組織中VEGF與c-fos表達(dá)均升高；c-fos可能通過上調(diào)VEGF表達(dá)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜組織血管生成，繼而引起EMs的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：子宮內(nèi)膜異位癥；血管內(nèi)皮生長因子；c-fos

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是指具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織，如腺體和間質(zhì)，出現(xiàn)在子宮腔被覆內(nèi)膜及宮體肌層以外的其他部位。育齡期婦女EMs的發(fā)病率為10%～15%[1],不孕癥患者發(fā)病率高達(dá)40%[2]。EMs是一種良性疾病，但具有轉(zhuǎn)移、侵襲等惡性生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，血管形成與EMs的發(fā)生密切相關(guān)[3,4]。c-fos、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是調(diào)節(jié)血管形成的重要因子，但其與EMs發(fā)病的關(guān)系鮮見報道。為此，我們進(jìn)行了如下研究。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2010年6月～2012年6月在我院行腹腔鏡和開腹手術(shù)的EMs患者23例，年齡24～47歲、平均35.6歲，均為卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫，無其他合并癥；既往月經(jīng)規(guī)律，術(shù)前6個月未服用任何激素類藥物，術(shù)后病理檢查確診為EMs；參照1985年美國生育學(xué)會修訂的EMs分期標(biāo)準(zhǔn)(r-AFS)，均為Ⅱ、Ⅲ期。術(shù)后取其異位內(nèi)膜組織23例份(異位內(nèi)膜組)，其中增生期12例份、分泌期11例份，HE染色后均可見子宮內(nèi)膜腺體；取其在位內(nèi)膜組織20例份(在位內(nèi)膜組)，其中增生期11例份、分泌期9例份。選取正常子宮內(nèi)膜組織21例份(對照組)，均由其他良性疾病行子宮切除或?qū)m腔鏡檢查刮宮所得，病理檢查證實(shí)均無子宮內(nèi)膜病變，其中增生期11例份、分泌期10例份。患者年齡26～48歲，平均36.3歲。

1.2VEGF表達(dá)檢測各組標(biāo)本分為兩份，一份立即浸泡在10%甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。采用免疫組化SP法檢測VEGF表達(dá)，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。采用Image-Pro Plus6.0軟件分析顯微鏡下放大400倍的VEGF免疫組化圖像。分析前先對陽性目標(biāo)彩色分割、編輯，獲得滿意圖形、圖像，選取相應(yīng)區(qū)域，測量其積分光密度(IOD)及面積，以IOD值除以測量面積得到平均光密度。每張切片在高倍鏡下選取10個視野，計算10次平均光密度，取平均值。

1.3c-fos表達(dá)檢測將另一份標(biāo)本立即放入液氮中，置于-80 ℃超低溫冰箱保存，采用蛋白免疫印跡法檢測c-fos表達(dá)。加入組織裂解液后提取蛋白，測定蛋白濃度，裂解組織以每孔30 μg上樣，行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉后依次加入兔抗人c-fos多克隆抗體、兔抗人actin多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，最后經(jīng)化學(xué)熒光發(fā)光法顯影試劑盒顯影，操作過程按說明書進(jìn)行。采用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行灰度掃描分析，相對表達(dá)量以c-fos灰度面積積分與內(nèi)參照肌動蛋白actin的比值表示。

2結(jié)果

異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組VEGF、c-fos表達(dá)均高于對照組，P均<0.05；異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組VEGF、c-fos表達(dá)比較，P均>0.05。見表1。直線相關(guān)分析顯示，子宮內(nèi)膜組織VEGF與c-fos表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.425，P<0.05)。

表1　各組VEGF、c-fos表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3討論

EMs是雌激素依賴性良性病變，但具有一些類似惡性腫瘤的生物學(xué)行為，特別是組織侵襲和血管形成能力。目前EMs發(fā)病機(jī)制尚未明確，以Sampson的經(jīng)血逆流種植學(xué)說為主。但經(jīng)血逆流至盆腔是普遍的生理現(xiàn)象,其中發(fā)生EMs者只占10%～15%[5]，提示經(jīng)血逆流可能只是誘因。因此，探討子宮內(nèi)膜在腹腔內(nèi)種植生長的機(jī)制才是闡明EMs發(fā)病的關(guān)鍵。目前認(rèn)為，黏附、侵襲、血管形成是內(nèi)膜異位種植的病理生理過程[6]，其中黏附和侵襲的過程很短暫，而異位種植病灶的發(fā)生和發(fā)展依賴于充足的血液供應(yīng)，故認(rèn)為血管異常增生是EMs發(fā)病的重要原因[7]。

VEGF具有多種生物學(xué)效應(yīng)，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)血管生長作用最強(qiáng)的因子[8，9]。原癌基因c-fos是受雌激素作用的靶基因之一，人類和小鼠c-fos基因啟動子區(qū)域存在功能性雌激素反應(yīng)元件，雌激素作用后c-fos表達(dá)顯著上升，并與Jun蛋白形成轉(zhuǎn)錄因子AP-1，調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲、生長及血管形成等相關(guān)靶基因的表達(dá)。因此，c-fos被認(rèn)為是雌激素早期應(yīng)答基因，可作為雌激素作用的早期感受分子[10，11]。“在位內(nèi)膜決定論”認(rèn)為， EMs患者在位內(nèi)膜組織VEGF表達(dá)明顯高于非EMs[6]。本研究異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組VEGF、c-fos表達(dá)均顯著高于對照組，而異位內(nèi)膜組與在位內(nèi)膜組VEGF、c-fos表達(dá)比較無統(tǒng)計學(xué)差異，與史淑紅等[12]研究結(jié)論一致，均支持“在位內(nèi)膜決定論”，提示EMs患者在位內(nèi)膜組織血管生成能力較正常子宮內(nèi)膜組織增強(qiáng)，一旦逆流進(jìn)入腹腔，很容易產(chǎn)生新生血管，并進(jìn)一步侵襲、發(fā)展，促使異位內(nèi)膜的成功種植和發(fā)展。Rein等[13]研究顯示，異位內(nèi)膜組織VEGF表達(dá)高于在位內(nèi)膜組織，本研究結(jié)果與其不同。可能與本研究采集異位內(nèi)膜標(biāo)本不同有關(guān)，新形成的異位內(nèi)膜組織VEGF表達(dá)可能偏高，而陳舊性異位內(nèi)膜組織VEGF表達(dá)可能下降。

研究顯示，雌二醇通過c-fos上調(diào)乳腺癌組織VEGF表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌組織的血管形成[14]。Catar等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞表達(dá)VEGF,電泳遷移率試驗顯示TNF-α或IL-1β與TGF-β1共同作用后，通過c-fos激活VEGF基因啟動子區(qū)域，而小干擾RNA抑制c-fos表達(dá)或c-fos抑制劑則降低VEGF基因啟動子活性，并下調(diào)VEGF表達(dá)水平；提示c-fos是介導(dǎo)TNF-α、IL-1β與TGF-β1促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞表達(dá)VEGF的重要分子。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜組織中VEGF與c-fos表達(dá)呈正相關(guān)，說明c-fos可能通過上調(diào)VEGF表達(dá)而促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜組織血管生成，繼而導(dǎo)致EMs的發(fā)生。本研究為探討EMs的發(fā)病機(jī)制提供了新思路，有望為EMs臨床治療提供新靶點(diǎn)。

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中圖分類號：R711.71

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1002-266X(2016)08-0063-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.08.025

通信作者：張萍(E-mail： shxinhuazp@163.com)

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項目(81100410)；上海市自然科學(xué)基金資助項目(10ZR1420200)。