120例耐多藥肺結核中醫證候與基因突變的研究

黃穎新　潘景芝　汪洋　閆娜　孫集思

【摘 要】 目的：通過對耐多藥肺結核中醫證候與耐藥基因突變的探討，初步明確耐多藥肺結核客觀化指征。方法：選擇120例耐多藥肺結核患者，利用現代基因芯片檢測技術，測定分枝桿菌對利福平、異煙肼耐藥的基因突變位點，并分析比較其在各中醫證候間出現的幾率。 結果：利福平耐多藥肺結核基因突變位點主要集中于rpoB-531（62.50%）和rpoB-526（19.17%）二個位點，其中在rpoB-531基因突變位點上，陰虛火旺證、氣陰兩虛證比肺陰虧虛證、陰陽兩虛證發生率顯著增高；在rpoB-526基因突變位點上，肺陰虧虛證比陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證發生率明顯增高。異煙肼耐藥基因在KatG315基因突變位點上，肺陰虧虛證比陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證發生率顯著增高；在inhA15基因突變位點上，陰陽兩虛證比肺陰虧虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證發生率明顯增高。結論：耐多藥肺結核利福平耐藥基因位點rpoB-526和/或KatG315突變可作為肺陰虧虛證的辨證指征，inhA15突變作為陰陽兩虛證的辨證指征，rpoB-531突變可作為陰虛火旺證、氣陰兩虛證的辨證指征。

【關鍵詞】 耐多藥肺結核；中醫證候；基因突變

【中圖分類號】R259 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）06-0078-03

2007年我國被世衛組織列為全球25個耐多藥結核病和嚴重耐多藥結核病最優先控制的國家之一，且位居第一位。耐多藥結核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）和廣泛耐藥結核病（extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）已成為世界范圍最為嚴重的流行疾病，其治療費用多，治愈率低，死亡率高，是結核病控制所面臨的最大難題[1]。證候是中醫臨床診斷和治療的邏輯起點，是辨證論治的核心，加強揭示規律和本質的中醫證候學研究具有重要的意義[2]。本研究選取120例耐多藥肺結核病例，應用現代分子基因芯片檢測技術分析利福平、異煙肼耐藥基因突變位點與中醫證候的關系，初步明確耐多藥肺結核中醫證候客觀化指征，為提高辨證論治水平奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月至2014年12月住院及門診耐多藥結核病患者120例，其中男97例，女23例。年齡18～65歲，平均年齡（45.64±15.55）歲，病程3～600個月，平均病程（56.24±31.52）月。所有患者均符合《耐藥結核病防治手冊》[3]關于耐多藥肺結核的診斷，以及國家中醫藥管理局頒布的《中醫證候診斷標準》[4]、《中藥新藥臨床研究指導原則》[5]等關于“肺癆（肺結核）”的診斷標準。排除標準：①罹患各系統重大疾病、長期服用免疫調節劑等可能干預中醫證候判斷的患者；②妊娠期或哺乳期婦女、精神病患者；③合并肺外結核病者。

1.2 中醫證候診斷標準 ①肺陰虧虛證。主癥：干咳，盜汗，手足心熱；次癥：痰中帶血絲或血點，咳聲短促，胸部隱隱作痛，口燥咽干，顴紅，皮膚干灼；舌紅少津，脈細或細數。②陰虛火旺證。主癥：嗆咳氣急、午后潮熱、盜汗；次癥：時時咯血色鮮紅，形體消瘦，五心煩熱，骨蒸，失眠，顴紅，口渴，胸脅掣痛，痰少質粘或痰黃稠量多，口燥咽干；舌紅干，苔薄黃或見花剝苔，脈細數。③氣陰兩虛證。主癥：氣短聲低、午后潮熱、自汗與盜汗并見；次癥：咳痰清稀、咳嗽無力，痰中夾血血色淡紅，神疲乏力，畏風怕冷，納呆，顴紅，面色晄白；舌光淡，邊有齒印，脈細弱而數。④陰陽兩虛證。主癥：形寒肢冷，自汗，盜汗；次癥：潮熱，五更泄瀉，面浮肢腫，咳逆喘促少氣，咯痰色白，痰中帶血絲色暗淡，男子遺精，女子經少或經閉；舌質光淡甚者隱紫，少津，脈細數或虛大無力。以上以主癥必備其中兩項，次癥兼具兩項以上，綜合舌、脈象即可診斷，均由三位副主任中醫師以上職稱專家共同進行判斷。120例耐多藥肺結核患者中肺陰虧虛證者11例，其中男9例，女2例，年齡20～64歲，平均年齡（44.09±16.18）歲，病程6～580個月，平均病程（57.18±30.96）月；陰虛火旺證者49例，其中男39例，女10例，年齡18～64歲，平均年齡（46.33±14.65）歲，病程3～590個月，平均病程（56.07±29.45）月；氣陰兩虛證者46例，其中男38例，女8例，年齡18～65歲，平均年齡（45.87±16.21）歲，病程5～600個月，平均病程（57.58±31.22）月；陰陽兩虛證者14例，其中男11例，女3例，年齡19～65歲，平均年齡（46.23±15.34）歲，病程3～590個月，平均病程（57.41±32.15）月。各組患者男女比例，平均年齡以及平均病程等一般資料比較，差異均不具有統計學意義，組間具有可比性（P>0.05）。

1.3 基因芯片方法 選用Evidenceinvestigator-生物芯片儀（英國朗道實驗診斷有限公司生產）。核酸提取：取 2ml痰標本于標本消化管內，加入NaOH-NALC 2ml。室溫靜置15min。提取1ml的標本處理液離心5min（12000r/min）共2次。向離心管內加入80μl核酸提取液，渦旋振蕩混勻后移入核酸提取管。將核酸提取管于超聲振蕩器中震蕩15min。待水浴鍋溫度達到 95℃以上后，將核酸提取管放入其中處理5min。取出后離心1min（12000r/min）。擴增：將PCR擴增試劑1、2、3分裝擴增管中，18μl/管，每個管中加入2μl 模板DNA、陽性質控品或陰性質控品，做好標記。將擴增管放入擴增儀以下表的程序擴增。雜交：根據樣品數目（n） 取2n個PCR管置于PCR架上，排成兩排，同一列編排為一組，分別向PCR管內加入9μl雜交緩沖液；取出PCR產物，分別向列排管中加入反應體系一3μl，在上側管內加入3μl對應體系二充分吸打混勻，在下側管內加入3μl對應體系三充分吸打混勻，各反應體系共計15μl。將雜交混合物置于PCR儀上95℃加熱5min，待其變性后立即放入冰水混合物中冰浴3min。吸取13.5μl雜交混合物加入雜交反應盒芯片點陣中，密封雜交盒。將雜交盒放入50℃預熱20min的雜交儀中；50℃雜交2h，轉速5r/min。讀取：取出雜交反應盒組芯片，放入洗干儀進行洗滌甩干。將處理好的芯片放入掃描儀，讀出結果。

1.4 觀察指標 觀察結核分枝桿菌對利福平、異煙肼耐藥相關基因突變位點在中醫各證候間出現的幾率。

1.5 統計學處理 數據采用SPSS 12. 0軟件進行統計學處理和分析，其中計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 耐多藥肺結核利福平耐藥基因位點與中醫證候的相關性分析 利福平耐多藥肺結核基因突變位點主要集中于rpoB-531（62.50%）和rpoB-526（19.17%）二個位點，其中在rpoB-531基因突變位點上，陰虛火旺證、氣陰兩虛證與肺陰虧虛證、陰陽兩虛證比較，有顯著統計學差異（P<0.05），說明陰虛火旺證、氣陰兩虛證與肺陰虧虛證、陰陽兩虛證比較，其rpoB-531基因突變發生率顯著增高，提示rpoB-531基因突變可作為陰虛火旺證和氣陰兩虛證的基因辨證特征之一；在rpoB-526基因突變位點上，肺陰虧虛證與陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證比較，有顯著統計學差異（P<0.05），說明肺陰虧虛證與陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證比較，其rpoB-526基因突變發生率明顯增高，提示rpoB-526基因突變可作為肺陰虧虛證的基因辨證特征之一。具體見表1。

2.2 耐多藥肺結核中醫證候不同位點基因突變發生率的比較 耐多藥肺結核異煙肼耐藥基因在KatG315基因突變位點上，肺陰虧虛證與陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證比較，統計學有極顯著性差異（P<0.05），說明肺陰虧虛證與陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證等三型比較，其KatG315基因突變發生率更高，提示KatG315基因突變可作為肺陰虧虛證的基因辨證特征之一；在inhA15基因突變位點上，陰陽兩虛證與肺陰虧虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證比較，有極顯著統計學差異（P<0.05），說明陰陽兩虛證與肺陰虧虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證比較，其inhA15基因突變發生率明顯增高，提示inhA15基因突變可作為陰陽兩虛證的基因辨證特征之一。具體見表2。

3 討論

耐藥結核病是指經體外藥物敏感等試驗證實，結核分枝桿菌對一種或多種抗結核化學治療藥物耐藥，目前共分四大類：單耐藥結核病、耐多藥結核病、多耐藥結核病以及廣泛耐藥結核病。耐多藥結核病（簡稱MDR-TB）是指結核分枝菌經體外證實至少同時對利福平、異煙肼兩種以上抗結核藥物產生耐藥。結核分枝桿菌發生耐藥的機制包括靶結構基因突變、藥物失活酶作用、細菌胞壁通透性改變和代謝途徑改變等多種模式，而目前已證實的主要機制是由于菌內藥物作用靶編碼基因突變所致[6]。多項研究表明利福平的耐藥發生與RNA聚合酶β亞基的編碼基因rpoB突變密切，異煙肼的耐藥發生與過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因katG的缺失和突變及烯酰基還原酶編碼基因inhA基因突變高度相關[7]。

基因芯片技術以其具有高通量、簡便、微縮、平行化、集約化等方面的優點，中醫藥臨床和研究領域如中醫證候研究、中藥藥理學研究、中藥有效成分篩選、中藥毒性及不良反應研究等方面被廣泛應用，在分子生物學與中醫藥學研究之間架起了一座技術橋梁，為中醫藥客觀化和標準化研究提供了技術上的保障。結核分枝桿菌對抗結核化學治療藥物產生耐藥的最主要機制為細菌菌體內藥物作用靶編碼基因的發生突變所致，利福平耐藥的產生與結核菌RNA聚合酶β亞基的編碼基因rpoB突變密切相關，異煙肼耐藥與過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因katG的缺失、突變及烯酰基還原酶編碼基因inhA基因突變高度相關，因此，通過利用基因芯片耐藥檢測技術，探討耐多藥肺結核中醫證候與利福平、異煙肼耐藥基因突變位點之間相關性和內在聯系，將有助于闡明基于基因水平的耐多藥肺結核中醫證候之本質。通過耐多藥肺結核中醫證候本質和規律的研究，將有助于了解其疾病的病因、病機，為臨床辨證提供參考、證候標準的修訂與完善提供依據。

本研究結果表明，利福平耐多藥肺結核基因突變位點主要集中于rpoB-531和rpoB-526二個位點，其中在rpoB-531基因突變位點上，陰虛火旺證、氣陰兩虛證比肺陰虧

虛證、陰陽兩虛證基因突變發生率顯著增高；在rpoB-526基因突變位點上，肺陰虧虛證比陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證突變發生率明顯增高。異煙肼耐藥基因在KatG315基因突變位點上，肺陰虧虛證比陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證基因突變發生率顯著增高；在inhA15基因突變位點上，陰陽兩虛證比肺陰虧虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證基因突變發生率明顯增高。李桂蓮等[8]分析了30株利福平耐藥菌株的rpoB基因突變情況：總突變率為96.7%，其中rpoB 531突變率為70.0%，rpoB 526突變率為16.7%，利福平MIC≥32.00μg/ml與0.500～16.00μg/ml相比，菌株rpoB 531和rpoB 526基因位點的突變發生率高，推斷rpoB基因突變與利福平高水平耐藥有關。孫鳳丹等[9]利用PCR-SSCP方法發現KatG菌耐異煙肼臨床分離株是主要的基因突變類型，說明KatG在INH耐藥中起主導作用，但某些菌株的耐異煙肼可能與KatG無關，而與inhA基因突變有關。因此，KatG基因突變是異煙肼耐藥性的重要分子機制，inhA基因突變是重要的輔助機制。

綜上所述，耐多藥肺結核利福平耐藥基因位點rpoB-526和/或KatG315突變可作為肺陰虧虛證的辨證指征，inhA15突變作為陰陽兩虛證的辨證指征，rpoB-531突變可作為陰虛火旺證、氣陰兩虛證的辨證指征。

參考文獻

[1]Huang Z， Qin C， Du J， et al. Evaluation of the microscopic observation drug susceptibility assay for the rapid detection of MDR-TB and XDR-TB in China： a prospective multicentre study[J]. J Antimicrob Chemother， 2015， 70（2）： 456-462. （ PMID： 25266071）

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[8]李桂蓮，張敬蕊，趙秀芹，等. 結核分枝桿菌對異煙肼和利福平的耐藥水平與其耐藥基因突變的相關性研究[J]. 中國防癆雜志，2012，34（6）： 354-359.

[9]孫鳳丹，李月龍，韓忠波. 結核分支桿菌耐異煙肼分子機制的研究[J]. 中國實用醫學，2011，6（22）：102-103.

（收稿日期：2016.01.09）