PDX-1聯合利拉魯肽誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為胰島樣細胞的效果*

閆淑芳，吳　敬， 劉宏霞，杜少斐，張會峰，史曉陽，袁　倩，袁慧娟

鄭州大學人民醫院內分泌科 鄭州 450003

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PDX-1聯合利拉魯肽誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為胰島樣細胞的效果*

閆淑芳，吳敬， 劉宏霞，杜少斐，張會峰，史曉陽，袁倩，袁慧娟#

鄭州大學人民醫院內分泌科 鄭州 450003

關鍵詞胰十二指腸同源盒-1；利拉魯肽；大鼠；骨髓間充質干細胞；胰島樣細胞

摘要目的：探討胰十二指腸同源盒-1(PDX-1)聯合利拉魯肽誘導大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)分化為胰島樣細胞(IPCs)的效果。方法：構建真核表達載體pEGFP-pcDNA3.1(+)-PDX-1，脂質體介導其轉染貼壁培養法分離得到的大鼠BMSCs，用潮霉素篩選穩定轉染細胞PDX-1-BMSCs。將BMSCs和PDX-1-BMSCs分別用50 nmol/L利拉魯肽或培養液培養10 d，然后ELISA法檢測細胞上清胰島素濃度，real-time PCR法檢測細胞中Tle、Nkx6.1、Ngn3、Nestin、PDX-1 mRNA的表達。結果：4組細胞誘導過程中形態上趨向胰島樣細胞分化；利拉魯肽和PDX-1均可誘導BMSCs胰島素分泌水平增加(P<0.05)；PDX-1可促進BMSCs中PDX-1、Ngn3、Nkx6.1、Tle mRNA的表達(P<0.05)；利拉魯肽可促進PDX-1、Ngn3 mRNA的表達(P<0.05)；兩者有協同作用的趨勢。結論：PDX-1 聯合利拉魯肽可以誘導BMSCs向IPCs分化并分泌胰島素。

Effect of PDX-1 combined with liraglutide on differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into insulin-producing cells

YANShufang,WUJing,LIUHongxia,DUShaofei,ZHANGHuifeng,SHIXiaoyang,YUANQian,YUANHuijuan

DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,thePeople′sHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450003

Key wordspancreatic duodenal homeobox-1;liraglutide;rat;bone marrow mesenchymal stem cell;insulin-producing cell

AbstractAim: To investigate the effect of pancreatic duodenal homeobox-1(PDX-1) and liraglutide on differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) into insulin-producing cells(IPCs). Methods: Eukaryotic expression vector pEGPF-pcDNA3.1(+)-PDX-1 was constructed, then transfected via liposome into rat BMSCs separated and purified by attachment culture method in vitro, and stable transfection cells PDX-1-BMSCs were screened by homomycin. PDX-1-BMSCs and BMSCs were cultured in the medium with or without 50 nmol/L liraglutide for 10 days. The secretion of insulin was measured by ELISA. The mRNA expressions of Tle, Nkx6.1,Ngn3,Nestin, and PDX-1 were detected by real-time PCR. Results: The morphology of induced cells trended to islet-like cluster cells in the differentiation process. PDX-1 transfection and liraglutide inducing could increase the secretion of insulin of BMSCs(P<0.05). PDX-1 transfection could increase the mRNA expressions of Tle, Nkx6.1,Ngn3, and PDX-1(P<0.05),and liraglutide inducing could increase the mRNA expressions of Ngn3 and PDX-1(P<0.05); PDX-1 transfection and liraglutide inducing had synergistic effect. Conclusion: PDX-1 combined with liraglutide could promote BMSCs differentiating into IPCs and secreting insulin.

由于供體來源不足及免疫排斥限制了胰腺和胰島移植應用于臨床，再生替代法治療糖尿病成為世界范圍內研究的焦點。對干細胞重新編程，誘導非β細胞分化為胰島樣細胞(insulin-producing cells,IPCs)成為再生替代療法的首選[1]。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一類具有很強自我更新和多項分化潛能的成體干細胞，處于未定向分化狀態，且其生長分化易受環境中營養物質的調節[2]。胰腺轉錄因子在胰腺β細胞的發育、分化及功能完善方面發揮重要作用。胰十二指腸同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)可以通過結合胰島素基因轉錄調控區A3激活胰島素基因轉錄，促進胰島素表達[3-4]。前期實驗[5-6]證實PDX-1可誘導BMSCs分化為IPCs并分泌胰島素，但體外誘導分化率較低。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-likepeptide1,GLP-1)是一種腸上皮細胞分泌的促胰島素分泌激素，可加速胰島前體細胞向β細胞轉化，促進β細胞的再生與修復。利拉魯肽是GLP-1長效類似物，研究[7]顯示利拉魯肽可誘導人BMSCs分化為IPCs，但胰島素分泌水平低下。該研究構建真核表達載體pcDNA3.1(+)-PDX-1并轉染BMSCs，穩定轉染株培養于含利拉魯肽的培養基，評價其胰島素分泌功能，即用PDX-1聯合利拉魯肽誘導BMSCs，以期獲得穩定分泌胰島素、功能更為完善的IPCs。

1材料與方法

1.1主要試劑、質粒及菌株質粒pEGFP-pcDNA3.1(+)-PDX-1為自行構建，測序無誤，于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。大鼠胰島瘤細胞株INS1購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。Trizol購自美國Invitrogen公司，cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR試劑盒、HindⅢ內切酶、BamHⅠ內切酶、T4連接酶、DH5α感受態細胞均購自大連寶生物公司。兔抗大鼠CD44、CD105、CD34抗體以及CCK-8試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。X-treme GENE HP DNA Transfection試劑購自瑞士Roche公司，胰島素ELISA檢測試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，real-time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，低糖(1.0 g/L)DMEM培養基購于北京索萊寶公司，胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.2BMSCs的分離培養及鑒定清潔級4周齡SD雄性大鼠20只，由河南省實驗動物中心提供。大鼠頸椎脫臼法處死，體積分數75%乙醇浸泡15 min，剝離雙后肢，分別使用無菌PBS和低糖DMEM培養基(含100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素)沖洗2次，剪斷長骨兩端，用2 mL注射器吸取低糖DMEM培養基沖洗骨髓腔，將沖洗液混勻，1 000 r/min離心 5 min，棄上清，沉淀用低糖DMEM培養基重懸后置于培養皿中，于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中進行培養，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。48 h后首次半量換液，此后每隔2～3 d全量換液1次。取第3代細胞(細胞數目不少于6×106個)，用流式細胞術法檢測表面抗原CD34、CD44和CD105的表達。

1.3穩定轉染PDX-1的BMSCs的構建及篩選

1.3.1質粒轉染BMSCs取第3代細胞(BMSCs)接種在6孔及24孔板內，轉染前用不含抗生素、含體積分數10%胎牛血清的低糖DMEM培養基培養24 h，當細胞融合至80%左右時進行質粒pEGFP-pcDNA3.1(+)-PDX-1的轉染。轉染開始前將培養基換成無抗生素無血清的低糖DMEM培養基，每孔加質粒3 μg，混勻，靜置5 min，加入3 μL轉染試劑，混勻，靜置20 min后觀察，以后每24 h觀察1次轉染效率。

1.3.2穩定轉染細胞的篩選、培養及鑒定預實驗證實潮霉素最小致死濃度為50 mg/L。BMSCs轉染質粒3 d后，加入50 mg/L潮霉素繼續培養2周，獲得穩定轉染PDX-1的BMSCs(PDX-1-BMSCs)。取PDX-1-BMSCs進行誘導分化：首先用無血清、含體積分數1%DMSO的低糖(5.5 mmol/L)DMEM培養液培養3 d，然后在含體積分數10%胎牛血清、1%DMSO的高糖(25 mmol/L)DMEM中培養。同時取pEGFP-C1(Invitrogen公司)轉染細胞，按同樣的程序進行處理以作對照。穩定轉染細胞培養72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況；高糖條件下培養7 d后提取總蛋白，Western blot法檢測PDX-1蛋白的表達。

1.4利拉魯肽濃度篩選取PDX-1-BMSCs，以2×104個/孔接種于6孔板，分別用含0、1、10、50、100 nmol/L利拉魯肽和體積分數10%胎牛血清的低糖DMEM培養基培養3 d，收集培養基并離心，上清保存于EP管中，ELISA法檢測上清中胰島素水平。實驗重復3次。

1.5PDX-1聯合利拉魯肽對MSCs誘導分化作用的觀察

1.5.1實驗分組共設4組。對照組：BMSCs；PDX-1誘導組：PDX-BMSCs;利拉魯肽誘導組：將BMSCs用50 nmol/L利拉魯肽誘導培養10 d；聯合誘導組：將PDX-BMSCs用50 nmol/L利拉魯肽誘導培養10 d。采用雙硫腙染色對4組細胞進行形態學觀察。

1.5.2胰島素分泌量的檢測誘導10 d后，取各組細胞上清，用ELISA法檢測胰島素濃度，按ELISA試劑盒說明操作，每個樣本重復3次。

1.5.3相關基因mRNA的檢測取各組細胞，Trizol法提取總RNA，檢測Tle、Nkx6.1、Ngn3、Nestin、PDX-1 mRNA。按real-time PCR試劑盒說明配制反應體系，使用ABI7300進行基因擴增，引物見表1。獲取各組標本的擴增曲線、Ct值。每次PCR至少重復 3次。

表1　引物

1.6統計學處理采用SPSS 17.0進行統計學分析。不同利拉魯肽濃度組BMSCs胰島素分泌量的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，采用2×2析因設計的方差分析對PDX-1和利拉魯肽單用或聯合應用對BMSCs胰島素分泌量、相關基因mRNA表達的影響進行比較，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1BMSCs的鑒定骨髓沖洗液在培養24 h內即見有細胞貼壁生長；3 d后貼壁細胞增多，體積小，呈不規則圓形，中間透亮；7 d后可見細胞全部貼壁，呈不規則梭形，聚集成團塊狀；第8～10天細胞融合達90%，細胞呈長條狀梭形，多個核仁，可以傳代。傳代后細胞貼壁時間縮短，形態類似原代細胞，生長周期縮短，6～8 d即可傳代，細胞旋渦狀生長，呈纖維狀。取第3代細胞，經表面抗原鑒定，細胞CD44、CD105呈高表達，CD34表達率低，符合BMSCs表面抗原表達特性，鑒定為BMSCs。

2.2PDX-1-BMSCs的鑒定經50 mg/L潮霉素篩選后，細胞在熒光顯微鏡下可見到明顯的綠色熒光的表達，Western blot顯示篩選出的細胞穩定表達PDX-1蛋白(圖1)，證實PDX-1-BMSCs構建成功。

A：PDX-1-BMSCs；B：BMSCs。圖1　Western blot鑒定結果

2.3利拉魯肽最適濃度的確定0、1、10、50、100 nmol/L利拉魯肽組PDX-1-BMSCs胰島素分泌量分別為(1.583±0.229)、(1.661±0.148)、(2.258±0.608)、(4.635±0.054)和(4.786±0.041) mIU/L，隨利拉魯肽濃度的升高，胰島素分泌量逐漸增加(F=85.236，P<0.001)， 50、100 nmol/L利拉魯肽的促進胰島素分泌作用無差異，故選擇50 nmol/L為利拉魯肽最適濃度進行后續實驗。

2.4PDX-1聯合利拉魯肽對BMSCs的誘導分化作用

2.4.14組細胞的形態見圖2。對照組BMSCs培養前后細胞形態未見明顯變化，PDX-1誘導組，利拉魯肽誘導組和聯合誘導組細胞明顯聚集，雙硫腙染色為猩紅色。

2.4.24組細胞胰島素分泌量的比較見表2。

A～D：分別為對照組、PDX-1誘導組、利拉魯肽誘導組和聯合誘導組；1：雙硫腙染色前細胞形態(×100)；2：雙硫腙染色后細胞形態(×200)。圖2　雙硫腙染色前后細胞形態

mIU/L

F利拉魯肽=66.211，P<0.001；FPDX-1=159.174，P<0.001；F交互=4.710，P=0.062。

2.4.34組細胞相關基因mRNA表達的分析見表3。與對照組BMSCs比較，PDX-1誘導組細胞中PDX-1、Ngn3、Nkx6.1、Tle mRNA的表達增加(P<0.05)；利拉魯肽誘導組細胞中PDX-1、Ngn3 mRNA的表達增加(P<0.05)。兩者聯合對PDX-1、Ngn3、Tle、Nkx6.1和Nestin mRNA的表達無協同影響(P>0.05)。

表3　4組細胞PDX-1、Ngn3、Tle、Nkx6.1和Nestin mRNA的表達

3討論

胰腺轉錄因子單獨或聯合誘導BMSCs向IPCs分化是糖尿病替代療法的研究熱點[8-10]，其方法目前有兩種，病毒感染和脂質體轉染，其中脂質體轉染對細胞的要求較低、轉染效果穩定，且誘導后細胞應用在臨床工作中較為安全。但僅依靠胰腺轉錄因子誘導分化得到的IPCs功能并不完善[5-6]。有文獻[11]報道，利拉魯肽通過與靶器官細胞表面相應受體結合，具有促進胰島素分泌、促進胰島β細胞增殖分化等作用。所以，此次研究采用PDX-1聯合利拉魯肽的誘導方案，以期獲得功能更加完善的IPCs。

作者首先從SD雄性大鼠骨髓中分離出BMSCs，然后采用脂質體介導轉染PDX-1，轉染細胞經潮霉素篩選，得到穩定轉染PDX-1的BMSCs(PDX-1-BMSCs)，Western blot檢測結果顯示PDX-1-BMSCs能夠表達PDX-1蛋白。作者用不同濃度的利拉魯肽誘導培養BMSCs，發現在50與100 nmol/L利拉魯肽培養環境下，BMSCs的胰島素分泌水平最高，且兩個濃度組間差異無統計學意義。利拉魯肽主要是通過與細胞表面的GLP-1受體結合發揮作用[6]，據此考慮，同等細胞數量與PDX-1誘導條件下，50 nmol/L利拉魯肽可能幾乎與所誘導BMSCs表面的GLP-1受體完全結合，達到最佳的促進細胞增殖與再生的效果，故后續實驗中利拉魯肽的作用濃度選用50 nmol/L。

隨后的實驗中，作者著重觀察了PDX-1聯合利拉魯肽誘導BMSCs向IPCs分化的效果。結果顯示，PDX-1轉染和利拉魯肽誘導均可使BMSCs向IPCs分化，分化細胞可分泌胰島素，且兩者表現出協同作用的趨勢；PDX-1轉染可使BMSCs中PDX-1、Ngn3、Tle及Nkx6.1 mRNA的表達增強，利拉魯肽誘導可使BMSCs中PDX-1、Ngn3 mRNA的表達增強，且兩者表現出協同作用的趨勢；PDX-1轉染和利拉魯肽誘導對BMSCs中Nestin mRNA的表達均無顯著影響。PDX-1是胰腺分化發育過程中第一個最重要的轉錄因子, 在胚胎發育早期內外分泌細胞中表達，啟動干細胞向胰腺β細胞分化與發育并分泌胰島素[5-6]。Ngn3和Tle是主要調節胰腺內分泌細胞分化過程的因子[11-12]。Nkx6.1在胰腺發育不同階段的3個細胞群中表達：首先在早期胰腺胚芽中未分化的上皮細胞中表達，進而在增殖的胰島前體細胞中表達，最后在已分化的β細胞中表達[13-14]。Nestin是胰腺及神經細胞發育起始的標志。該研究結果說明，PDX-1轉染聯合利拉魯肽誘導BMSCs向IPCs分化的作用較好。PDX-1誘導的BMSCs可能處于胰島前體細胞與已分化的β細胞的中間階段，利拉魯肽誘導的BMSCs可能處于已分化的β細胞階段。考慮其原因可能為β細胞定向分化的必需因子在BMSCs內缺乏或處于未活化狀態，外源PDX-1的導入激活必需因子表達，同時抑制、干擾BMSCs向其他細胞分化發育[15]；有效濃度的利拉魯肽提供了有效誘導微環境，促進PDX-1誘導的IPCs的增殖、分化和修復，使得誘導的IPCs分泌胰島素的水平進一步提高。

該研究證實PDX-1 與利拉魯肽誘導的IPCs在胰島素相關基因表達水平方面分化并不完善，如隨著細胞的分化及成熟，Nestin的表達會明顯減少，甚至消失，但該研究中各組細胞Nestin表達并未減少或消失。為了進一步提高誘導分化的效率，后續研究可以嘗試PDX-1、MafA和Ngn3聯合誘導后，加入利拉魯肽進一步誘導分化。總之，該研究為誘導BMSCs分化為IPCs提供了新的方案。

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中圖分類號R587

#通信作者，女，1972年6月生，博士，主任醫師，研究方向：內分泌與代謝疾病，E-mail:lmls3712@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.006

*國家自然科學基金資助項目U1204805