熒光法測定果蔬中葉酸含量的研究

王　夢，張加玲

(山西醫科大學公共衛生學院衛生檢驗教研室，太原　030001)

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熒光法測定果蔬中葉酸含量的研究

王夢，張加玲

(山西醫科大學公共衛生學院衛生檢驗教研室，太原030001)

摘要：目的：建立水果蔬菜中葉酸含量的熒光測定方法。方法：樣品經NaOH提取后，在0.2mol/L HAc-NaAc(pH=4.76)反應介質中被KMnO4氧化，空白以1mol/L H2SO4作為反應介質進行氧化，在λ(ex)=280nm、λ(em)=445nm條件下測定。結果：葉酸濃度在6.0～90μg/L范圍內與ΔIF呈線性關系，線性回歸方程為ΔIF=778.24C+1.1，r=0.9998；方法精密度為1.49%；對獼猴桃、蘋果、梨、菠菜中葉酸含量進行測定，精密度為2.65%～9.95%，加標回收率為86.0%～107.5%，相對標準偏差為2.52%～8.73%。結論：本方法提取過程簡單、靈敏度高、結果的精密度和準確度高，可用于水果蔬菜中葉酸的測定。

關鍵詞：葉酸；熒光法；水果蔬菜

葉酸(folic acid，VM，蝶酰谷氨酸)屬于水溶性維生素，廣泛存在于新鮮水果、蔬菜、動物肝臟及豆類等食品中。葉酸在人體中作為一碳單位，參與人體的許多生理活動，葉酸缺乏可導致生理功能低下及某些疾病，如巨幼紅細胞貧血、智力退化、新生兒神經管畸形、骨質疏松等癥狀[1]的發生。貧血及骨質疏松患者、孕婦和老人應增加葉酸的攝入量。因此食物中葉酸的測定對指導人們日常飲食、預防疾病發生具有重要意義。

目前，葉酸檢測的主要方法有微生物法、液相色譜法、熒光法等[2]。微生物法為葉酸檢測的經典方法，該方法可檢測樣品的種類多，靈敏度較高，操作步驟、樣品處理簡便，不需提純處理，但是檢測周期長、重復性不是很好[3]。現在使用較廣泛的液相色譜法，適用范圍廣、分離效果好、分析速度快、測定結果準確。已有將HPLC、UPLC與質譜/串聯質譜技術聯用，同時結合同位素稀釋技術對食品和臨床樣品進行檢測[4-8]，不僅增加其檢測的準確度和靈敏度，還可對不同形態的葉酸進行測定。但其儀器設備要求高，且一般都通過固相萃取小柱富集、純化，操作步驟較復雜。熒光法快速、靈敏、選擇性好，儀器簡單。由于葉酸本身熒光較弱，將其氧化后產物的熒光強度可增加7～8倍，提高了測定的靈敏度。目前對水果蔬菜中葉酸的檢測，多是利用活性炭或高效液相色譜將葉酸分離后測定。本研究將采用直接堿性溶液提取、離心分離的方法，經KMnO4氧化后，用熒光法檢測水果蔬菜中的葉酸含量。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑

RF-540型熒光光度計(日本島津)；SC-2556型低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；葉酸標準品(含量≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；100μg/mL葉酸儲備液：準確稱取10mg葉酸標準品，用幾滴0.01mol/LNaOH溶解后，用蒸餾水定容至100mL，4℃避光冷藏，用時稀釋成不同濃度；0.2mol/L HAc-NaAc(pH=4.76)：0.2mol/L HAc和0.2mol/L NaAc按1：1(v/v)混合；0.01mol/L NaOH；0.1mol/L和1mol/L H2SO4；0.01mol/L KMnO4；1%H2O2(v/v)。

1.2工作曲線

將葉酸儲備液稀釋成中間液，取不同體積，用蒸餾水均補至3mL，使葉酸最終濃度為6、9、10、20、30、40、60、90μg/L，然后加3mL HAc-NaAc和0.5mL KMnO4進行氧化，放置20min后，用H2O2將過量的KMnO4還原，使溶液呈無色，用蒸餾水定容至10mL。對應空白加入等量葉酸后，以2ml H2SO4作為反應介質，經過相同氧化后，在λex=280nm、λem=445nm的條件下測定葉酸氧化物和空白的熒光I和I0，ΔIF=I-I0。ΔIF與葉酸濃度在6.0～90μg/L范圍內呈線性關系，線性回歸方程為ΔIF=778.24C+1.1，r=0.999 8。

1.3樣品提取與氧化

準確稱取適量樣品，研碎，加入0.01mol/L NaOH 20～30mL，水浴加熱10min，放至室溫后加入0.1mol/L H2SO4將NaOH完全中和，定容至100mL。離心10min(4 000r/min)，取上清液≤3mL，按1.2步驟加2mL KMnO4氧化測定。

2結果與討論

2.1檢測波長的選擇

按1.2步驟氧化葉酸，對其氧化物分別進行熒光光譜和激發光譜掃描。從光譜圖可知：葉酸氧化物的最大激發波長在280nm和360nm處，最大發射波長在445nm處。本試驗選擇280nm為激發波長；葉酸氧化物的熒光強度是同濃度葉酸的7～8倍，因此氧化后測定靈敏度可提高7～8倍。

2.2KMnO4用量對熒光強度的影響

取等量葉酸標準溶液，加入不同體積的KMnO4，放置20min后定容測定。結果見表1。

表1　KMnO4用量對葉酸氧化物熒光強度的影響

從表1可知，隨著KMnO4用量的增加，熒光強度逐漸降低。因此需將過量KMnO4除去，以消除其影響。綜合考慮后選用H2O2將多余的KMnO4還原。

2.3H2O2用量對熒光強度的影響

取7支10mL比色管，加入等量葉酸工作液和0.3mL 0.001mol/LKMnO4，放置20min后加入不同體積的10%H2O2，定容測定。從表2可知：隨著H2O2用量的增加，熒光強度先升高后降低。H2O2加入量小于0.3mL時KMnO4為過量，隨著KMnO4不斷被還原，其影響也逐漸減小，所以熒光強度逐漸增大；H2O2加入量為0.3mL時熒光強度達到最大；H2O2加入量大于0.3mL時，即H2O2過量后熒光強度逐漸降低。因此，試驗中H2O2不可過量，使溶液剛好呈無色即可。

表2　H2O2用量對葉酸氧化物熒光強度的影響

2.4反應介質的選擇

附圖　葉酸在不同pH反應介質中被氧化后的熒光強度

測定等量葉酸工作液在不同pH值的反應介質中被氧化后的熒光強度，結果見附圖。可以看出，葉酸在不同pH的反應介質中被氧化，其產物的熒光強度有很大不同。葉酸在HCl、HAc中氧化，產物的熒光強度雖然很強，但兩者pH變化會引起熒光強度很大變化，給樣品測定時條件控制帶來困難。因此選擇HAc-NaAc(pH=4.76)緩沖液作為反應介質。

2.5HAc-NaAc緩沖液用量的選擇

向5份等量葉酸工作液中加入不同量濃度為0.2mol/mL的HAc-NaAc(pH=4.76)緩沖液，經過相同氧化后在同一條件下測定，同時做空白。結果如表3。

表3　HAc-NaAc緩沖液用量對葉酸氧化產物熒光強度的影響

可以看出，隨著緩沖液用量的增加熒光強度逐漸降低，加入1mL的緩沖液即可獲得較高的熒光強度。但考慮到樣品測定的需要，所以選擇加入3mL的緩沖液。

2.6H2SO4用量的選擇

分別測定在0.5、1.0、2.0、3.0mL H2SO4體系中葉酸被KMnO4氧化后的熒光強度，同時對應做空白，結果如表4。

表4　H2SO4 用量對葉酸氧化產物熒光強度的影響

從表4可以看出，加入1.0mL H2SO4就可以將葉酸氧化物的熒光破壞，考慮到測定需要，選擇加入2.0mL H2SO4破壞氧化物的熒光，得到樣品中基質的熒光強度。

2.7精密度的測定

2.7.1方法精密度按1.2步驟平行測定6份濃度為60μg/L的葉酸氧化物的熒光強度，其相對標準偏差為1.49%。

2.7.2樣品精密度取不同樣品提取液氧化，按1.2步驟測定熒光強度，測定結果如表5，相對標準偏差在2.65%～9.95%之間。

表5　樣品精密度試驗(n=6)

2.8加標回收試驗

分別于提取前向樣品中加入3個濃度的葉酸標準溶液，測定結果如表6，加標回收率在86.0%～107.5%之間，相對標準偏差在2.52%～8.73%之間。

表6　加標回收率試驗(n=6)

3結論

葉酸在pH=4.76的HAc-NaAc緩沖液中其氧化產物有較強的熒光，利用這種方法對彌猴桃、蘋果、梨、菠菜中葉酸含量進行測定，提取過程簡單、結果的精密度和準確度均較好，可用于蔬菜水果中葉酸的定量測定。◇

參考文獻

[1]劉泰然，李潔，等.柱后衍生-高效液相色譜法測定保健食品、強化食品和營養素補充劑中的葉酸[J].中國衛生檢驗雜志，2008，18(2)：268-269，294.

[2]石丹，賈云虹，等.葉酸檢測方法的研究現狀及發展趨勢[J].中國乳品工業，2009，37(3)：42-45.

[3]郭麗瓊，等.果蔬中葉酸分析方法研究的進展[J].食品工業科技，2012，10(33)：402-406，411.

[4]Owens JE，Holstege DM，et al.Quantitation of total folate in whole blood using LC-MS/MS[J].J Agric Food Chem，2005，53(19)：7390-7394.

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[8]Jia Liu，Russell Pickford，et al.Quantitative analysis of tissue folate using ultra high-performance liquidchromatography tandem mass spectrometry[J].Analytical Biochemistry，2010，411(2011)：210-217.

(責任編輯李燕妮)

Determination of Folic Acid in Fruits and Vegetables by Fluorescence Method

WANG Meng，ZHANG Jia-ling

(DepartmentofSanitaryInspection，SchoolofPublicHealth，ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China)

Abstract：ObjectiveA quantitative method was developed for the analysis of folic acid in fruits and vegetables.MethodAfter being extracted by NaOH solution，the supernatant was oxidated by KMnO4 in 0.2mol/L HAc-NaAc(pH=4.76)，and the blank was in 1mol/L H2SO(4 ).The detection wavelengths of excitation and emission for the oxid were 280nm and 445nm respectively.ResultThe linear regression equation was ΔIF=778.24C+1.1 covering the range from 6.0～90μg/L with a correlation coefficient of 0.999 8.The method precision was 1.49%.The recoveries of spiked samples were between 86.0%～107.5% with RSD(n=6)ranging from 2.52% to 8.73%.ConclusionThis method was simple，sensitive and precise，which could be used in the quantitative detection of folic acid in fruits and vegetables.

Keywords：folic acid；fluorescence method；fruit and vegetable

通訊作者：張加玲(1961—)，女，碩士，碩士生導師，教授，從事衛生檢驗教學科研工作。

作者簡介：王夢(1989—)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品衛生檢驗。