面神經損傷大鼠面神經核團中NT-4 mRNA 蛋白質表達變化及意義

王　斐　尹浩軍　李　英　周紅星

武警湖北總隊醫院內二科　武漢　430064

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面神經損傷大鼠面神經核團中NT-4 mRNA 蛋白質表達變化及意義

王斐尹浩軍李英周紅星

武警湖北總隊醫院內二科武漢430064

【摘要】目的 分析面神經損傷大鼠面神經核團中神經營養素-4(NT-4)mRNA及蛋白質表達變化及意義。方法選取50只Wistar大鼠，所有大鼠右側制造面神經骨管內擠壓傷模型，左側作為自身對照。分別于處理后第1天、第7天、第14天、第21天、第28天采用原位雜交及免疫組化檢測大鼠面神經核團中NT-4 mRNA表達細胞數情況，并采用計算機圖像分析測定其灰度，NT-4蛋白表達樣本進行γ計數。結果正常大鼠面神經核團有較少NT-4表達。面神經損傷大鼠面神經核團中的NT-4 mRNA含量及NT-4蛋白表達均明顯升高，高于正常大鼠。面神經損傷大鼠面神經核團中的NT-4 mRNA含量及NT-4蛋白表達均于受損初期迅速增高，至損傷后14 d達最高值，隨后逐漸降低。結論面神經損傷可刺激大鼠面神經核團NT-4 mRNA含量及NT-4蛋白的表達，其變化趨勢為先迅速上升后逐漸下降，提示NT-4 mRNA含量及NT-4蛋白表達對面神經損傷的恢復具有重要意義。

【關鍵詞】面神經核團；損傷；Wistar大鼠；神經營養素-4

面神經損傷是臨床上最常見的顱神經損傷類型之一，可導致嚴重的顏面部感覺運動功能異常[1]。利用腦源性神經營養因子治療和修復面神經損傷是臨床研究的熱點，對面神經損傷后相關營養因子的變化及其表達具有重要價值[2～3]。本研究利用大鼠建立面神經損傷，測定其損傷后不同時段的NT-4 mRNA和蛋白表達情況，與自身正常側對比，探討其變化趨勢及病理生理作用。現報道如下。

1材料與方法

1.1實驗材料選取成年健康的Wistar大鼠50只由上海義森生物科技有限公司提供，雄性25只，雌性25只，體質量200～300 g，大鼠均在相同條件下喂養，飼料均為普通顆粒飼料。所有大鼠實驗分組及模型建立前均檢查面神經情況，確認大鼠觸須活動和瞬目反射正常后建立模型。實驗試劑：鼠疫組化染色試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，TRlzol試劑由北京明陽科華生物科技有限公司提供，逆轉錄試劑盒由杭州主諾生物技術有限公司提供，兔抗鼠NT-4多克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2方法

1.2.1分組及建立模型：50只大鼠均建立面神經損傷模型：采用10%水合氯醛(3 mL/kg)進行腹腔注射全麻，操作過程中維持體溫。于大鼠右耳后方作切口，切開皮下組織后暴露面神經，根據面神經走行至徑乳孔方向，夾碎面神經垂直段與水平段交界處顳骨，封閉傷口，縫合。所有大鼠左側作為自身對照，麻醉切開與右側相同，暴露面神經后不進行碎骨處理，封閉傷口，縫合。利用隨機數表法將所有大鼠分為第1天、第7天、第14天、第21天、第28天5個小組，每組10只。各組大鼠建立模型后混合喂養。

1.2.2標本處理及染色觀察：①NT-4 mRNA灰度測定采用RT-PCR測定：分別于各小組相應時間處死大鼠，進行標本制備觀察。大鼠處死后剪開原模型建立切口，采集10只大鼠腦干面神經核團水平標本。將標本置于-80 ℃冰箱封存。利用玻璃勻漿器將標本于液氮中研碎，并加入TRlzol試劑處理，提取總RNA。采用紫外分光光度計測定濃度后行反轉錄處理。PCR擴增處理提取的mRNA，并于1.5%～2.0%瓊脂糖電泳池中電泳，暗室照相后對特異性增條帶進行光密度掃描，計算平均灰度[4-5]。②NT-4 mRNA陽性細胞數采用組織原位雜交測定：處死與上述相同，獲得標本后保存于液氮中，并利用鼠NT-4 mRNA堿基序列為模版，進行漂浮法原位雜交，完成后進行染色。光鏡500倍視野下觀察mRNA陽性神經元數目[6]。③面神經核團NT-4蛋白采用γ計數進行測定：處死與上述相同，在放大鏡觀察下使用電鉆和絞骨鉗分離大鼠腦干面神經核團，并保存清潔測試管內，對樣本進行γ計數，測定NT-4陽性細胞數[7]。

2結果

2.1面神經損傷后大鼠面神經核團NT-4 mRNA陽性細胞數情況觀察大鼠面神經損傷后面神經核團NT-4 mRNA陽性細胞數。可見大鼠損傷側的面神經NT-4 mRNA陽性細胞數呈先上升后下降的趨勢，于第14天達到高峰。且大鼠損傷側第7天、第14天、第21天、第28天的面神經核團NT-4 mRNA陽性細胞數均明顯高于正常側，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　面神經損傷后大鼠面神經核團NT-4 mRNA陽性細胞數比較　±s，個)

2.2面神經損傷后大鼠面神經核團NT-4 mRNA灰度情況比較觀察大鼠面神經損傷后面神經核團NT-4 mRNA灰度情況?？梢姄p傷側的面神經核團NT-4 mRNA灰度呈先上升后下降的趨勢，于第14天達到高峰。且大鼠損傷側第7天、第14天、第21天、第28天的面神經核團NT-4 mRNA灰度均明顯高于正常側，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3面神經損傷后大鼠面神經核團NT-4蛋白情況比較大鼠損傷側的面神經核團NT-4蛋白γ計數呈先上升后下降的趨勢，于第14天達到高峰。且大鼠損傷側第7天、第14天、第21天、第28天的面神經核團NT-4蛋白γ計數均明顯高于正常側，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表 2　面神經損傷后大鼠面神經核團NT-4 mRNA

表3　面神經損傷后大鼠面神經核團NT-4蛋白γ計數情況比較　±s，cpm)

3討論

染色后各組大鼠著色情況比較發現，正常面神經核團可觀察到分布較廣泛的藍紫色信號。通過高倍鏡觀察可見，神經元細胞核周和胞漿有明顯著色，其中核膜著色最明顯，部分神經元細胞胞漿與胞核之間有明顯界限。與相關研究中可通過免疫組化染色觀察神經營養素表達情況的結論相符[8-9]。同時觀察到NT-mRNA藍紫色信號在腹側核最明顯，且主要為大多角形的神經元細胞，部分周圍膠質細胞染色染色相對較淺。觀察還發現，在藍紫色信號區域可見較明顯棕黃色著色物質，高倍鏡觀察可見明顯胞漿著色，且胞核無明顯染色。此為NT-4蛋白，與NT-4 mRNA分布位置基本一致，是重要的神經營養素。

在對大鼠損傷后第1天NT-4 mRNA染色觀察中發現，損傷與未損傷兩側面神經核團染色情況比較差異并不明顯，說明在面神經損傷初期大鼠的NT-4 mRNA含量情況變化并不明顯。研究[10-11]指出，在面神經損傷的最初期，其營養因子的mRNA的變化并不明顯，隨著時間的推移出現代償性增高。在面神經損傷第7天進行染色觀察，發現面神經損傷側的神經元著色信號明顯增加。損傷側500倍視野NT-4 mRNA陽性細胞數為(39.31±5.42)個，正常側為(34.21±4.33)個，損傷側NT-4 mRNA陽性細胞數更多，濃度更高。同時，在對蛋白質表達情況的觀察中也發現，損傷側NT-4蛋白陽性γ計數為(1 192.5±128.1)cpm，明顯高于正常側的(914.5±128.4)cpm。結果證明，在面神經損傷后第7天，損傷側的NT-4 mRNA含量及蛋白表達情況均明顯高于正常側。

研究顯示，腦神經損傷后，多種神經營養因子如NT-3和NT-4等均可能出現不同程度的反應性增加[12]。尤其是在神經損傷部位其分泌和表達情況最明顯，而作為神經修復重要部位的神經核團，神經營養素的高表達具有重要意義[13]。面神經損傷后的神經修復需要NT-4等大量相關促神經生長因子作用，因此，在面神經核團處NT-4的高表達可促進神經損傷修復[14]。

隨著損傷時間的不斷推移，本研究中大鼠面神經損傷側的NT-4 mRNA含量呈逐漸升高后下降的趨勢。研究顯示，大鼠面神經損傷后，面神經核團將分泌大量營養因子促進其功能恢復[15]。第14、21、28 d的染色結果發現，損傷組大鼠的面神經NT-4 mRNA陽性細胞數于損傷后先上升，至第14天達到高峰，而后不斷下降。在這一變化過程中大鼠損傷側的面神經核團NT-4 mRNA陽性細胞數均明顯高于正常側。但在損傷后第28天的染色結果分析中發現，二者陽性細胞數比較并無明顯差異。在對NT-4 mRNA電泳帶灰度情況比較中也得出相同結論，說明損傷后面神經核團NT-4 mRNA陽性細胞數增加，且NT-4 mRNA的總含量明顯上升，于損傷后28 d方恢復至正常水平。同時，本研究也發現損傷后面神經核團中，神經營養素的表達的變化趨勢與其mRNA濃度情況變化相一致。

綜上所述，面神經損傷后，面神經核團NT-4 mRNA含量增高，促使NT-4蛋白的表達。損傷后其變化趨勢為先迅速上升后逐漸下降，NT-4 mRNA含量及NT-4蛋白表達對面神經損傷的恢復具有重要意義。損傷后可使用外源性神經營養素提高恢復效果，改善癥狀。

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(收稿2015-03-03)

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)04-0038-03