應用通用引物PCR檢測診斷細菌和真菌性中樞神經系統感染的價值

曹敬榮，陳　靜,2，高世超，陳典典，王培昌

(1 首都醫科大學宣武醫院，北京　100053； 2 江西衛生職業學院，江西 南昌　330201)

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·論著·

應用通用引物PCR檢測診斷細菌和真菌性中樞神經系統感染的價值

曹敬榮1，陳靜1,2，高世超1，陳典典1，王培昌1

(1 首都醫科大學宣武醫院，北京100053； 2 江西衛生職業學院，江西 南昌330201)

[摘要]目的了解細菌和真菌性中樞神經系統(CNS)感染病原譜，并探討通用引物聚合酶鏈反應(PCR)檢測技術的病原學診斷價值。方法收集某院2009年1月—2015年3月疑似或確診CNS細菌或真菌性感染患者資料，分析其腦脊液培養病原菌種類，采用細菌16S rRNA和真菌28S rRNA通用引物對患者腦脊液DNA進行PCR擴增和序列測定，并與同期腦脊液培養及鑒定結果進行比較。結果共收集確診或疑似CNS細菌或真菌感染者400例，其中腦脊液培養陽性132例。共分離病原菌150株，其中革蘭陽性菌48株，革蘭陰性菌90株，真菌12株；居前3位的細菌為鮑曼不動桿菌(32株)、凝固酶陰性葡萄球菌(16株)和肺炎克雷伯菌(13株)；最常見真菌為新生隱球菌(8株)。選取88份感染患者腦脊液標本和20例非感染患者腦脊液進行PCR擴增，PCR擴增法靈敏度(35.23%，31/88)高于培養法(28.41%，25/88)(χ2=4.17，P<0.05)。PCR擴增和培養法陰性預測值分別為25.97%、24.10%，兩種方法的特異度、陽性預測值均為100.00%。PCR擴增測序與培養結果符合率為84.00%(21/25)；PCR檢測平均報告時間(48 h)較培養結果報告時間(細菌平均約72 h，真菌平均約96 h)更快速。結論CNS 感染病原分布廣泛，以革蘭陰性菌為主；通用引物PCR檢測具有快速、靈敏、準確等特點，具有良好的臨床推廣和應用價值。

[關鍵詞]中樞神經系統感染； 腦膜炎； 腦脊液； 顱內感染； 病原體； 通用引物； 鑒定

[Chin J Infect Control，2016，15(3)：145-149]

中樞神經系統(central nervous system,CNS)感染嚴重威脅人類健康，病死率和致殘率高。細菌性/真菌性腦膜(腦)炎是較常見的CNS感染，但其病原學確診常由于微生物培養時間長、陽性率低、抗菌藥物的使用等原因而延誤[1-3]。準確、快速的病原診斷是微生物實驗室協助臨床正確治療的前提和關鍵，為此筆者對2009—2015年某院腦脊液培養病原譜進行分析，并利用細菌/真菌通用引物對確診或疑似CNS細菌或真菌感染的患者腦脊液進行聚合酶鏈反應(PCR)檢測，探討通用引物PCR檢測技術對CNS感染病原學診斷的價值，探索早期、快速、準確診斷CNS感染的新方法。

1材料與方法

1.1臨床資料回顧性分析首都醫科大學宣武醫院2009年1月—2015年3月神經內科、神經外科和門診確診或疑似CNS細菌或真菌感染的病例，收集其腦脊液進行培養，留存腦脊液1～2 mL置于-80℃保存。細菌/真菌CNS感染診斷標準參照《醫院感染診斷標準(試行)》[4]中顱內感染臨床診斷并稍作修改：符合下列條件之一即考慮CNS感染：(1)高熱、顱高壓癥狀(頭痛、嘔吐、意識障礙等)、腦膜刺激征(頸抵抗、角弓反張等)，并有腦脊液炎性改變(白細胞>10×106/L，葡萄糖<2.25 mmol/L，蛋白>0.45 g/L)；(2)腦脊液白細胞輕至中度升高或呈上升趨勢，經抗菌藥物治療后癥狀體征消失、腦脊液恢復正常； (3)出現發熱、不典型顱高壓癥狀體征、腦脊液白細胞輕度增多，并具有下列情況之一：①腦脊液中抗特異性病原體的IgM達診斷標準，或IgG呈4倍升高，或腦脊液涂片找到細菌；②有顱腦侵襲性操作(如顱腦手術、顱內穿刺、顱內植入物)史，或顱腦外傷或腰椎穿刺史；③腦膜附近有感染灶(如頭皮切口感染、顱骨骨髓炎等)或有腦脊液漏者；④新生兒血培養陽性。排除腦腫瘤、腦出血及其他致病微生物(如病毒等)所致顱內感染，表現為發熱和細胞數升高病例。

1.2試劑與儀器PCR擴增試劑，包括premix Taq酶、buffer、DL2000Marker等(大連寶生物公司)；QIAamp UCP Pathogen Mini Kit、Pathogen Lysis Tubes(L)和DNeasy Blood Mini Kit(Qiagen,Germany)；細菌和酵母菌DNA提取試劑盒(天根生化科技公司)。主要儀器為PCR儀(Veriti 9902, Applied Biosystems, USA)、電泳儀(北京六一儀器廠)、凝膠成像儀(U-Genius, Gene Company, UK)和VITEK 2 Compact自動化鑒定儀(法國生物梅里埃公司)。引物合成和序列測定委托上海Inventrogen公司。

1.3基因組DNA提取凍存腦脊液室溫融化后取1 mL加入Pathogen Lysis Tube中，13 400 r/min離心5min，棄上清，加入試劑盒配套緩沖液ATL(含試劑DX)懸浮顆粒，渦旋振蕩器振蕩10 min，短暫離心，吸取400 μL上清液置于無菌EP管中，按試劑盒操作說明提取DNA模板(20～100 μL)，置于-20℃保存備用。標準菌株和臨床分離菌株DNA提取按天根細菌和酵母菌DNA提取試劑盒說明進行操作。

1.4PCR擴增及最低檢出限測定參照文獻[3,5]合成細菌和真菌通用引物，可涵蓋所有細菌和真菌(包括酵母菌及霉菌)。細菌通用引物序列為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；真菌通用引物序列為P1:5’-ATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’和P2：5’-CTCTGGCTTCACCCTATTC-3’與ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR反應體積為25 μL，反應體系為Premix Taq 12.5 μL，上下游引物各1 μL(濃度10 μmol/L)，模板DNA 5 μL，無菌雙蒸水5.5 μL。反應條件參考文獻[3,5]進行，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳(100 V，30 min)在紫外凝膠成像儀下成像觀察條帶，細菌和真菌目的條帶分別為1 500和500～800 bp。陽性對照模板：細菌為大腸埃希菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 25923，真菌為新生隱球菌ATCC 204092和白假絲酵母菌ATCC 10231菌懸液；陰性對照為無菌雙蒸水。最低檢出限檢測:選取大腸埃希菌ATCC 25922和白假絲酵母菌ATCC 10231菌液10倍比稀釋，提取不同濃度菌液DNA進行PCR擴增，測試PCR擴增陽性所需最低樣本含菌量(CFU/mL)。

1.5病原菌鑒定采用VITEK 2 Compact自動化鑒定儀鑒定病原體種屬；PCR產物測序后與Genbank數據庫進行Blast比對，挑選最佳比對結果鑒定病原體種屬。

1.6統計分析應用SPSS 17.0統計軟件，采用χ2檢驗對兩種檢測方法的陽性率進行比較，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1病原菌種類共收集確診或疑似CNS細菌或真菌感染者400例，其中腦脊液培養陽性132例，年齡17～90歲(平均54歲)，男女比例為3∶2。16例患者在不同時期分離出多株不同病原菌，未發現同一份標本混合感染者。共分離病原菌150株，其中革蘭陽性菌48株，革蘭陰性菌90株，真菌12株；居前3位的細菌為鮑曼不動桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌和肺炎克雷伯菌；最常見真菌為新生隱球菌。詳見表1。

表1　腦脊液分離病原菌種類及構成

2.2PCR擴增與培養陽性率比較選取88份感染患者腦脊液標本和20例非感染患者腦脊液進行PCR擴增，結果31份陽性，其中細菌25株，真菌6株；同期腦脊液培養陽性者25份，分離細菌21株，真菌4株。20例非感染患者腦脊液，以及陰性對照(無菌雙蒸水)結果均為陰性。PCR擴增法靈敏度為35.23%(31/88)，高于培養法的28.41%(25/88)(χ2=4.17，P<0.05)。PCR擴增和培養法陰性預測值分別為25.97%、24.10%，兩種方法的特異度、陽性預測值均為100.00%。詳見表2。4例細菌培養陰性者經PCR檢測，結果為人蒼白桿菌2例，銅綠假單胞菌和大腸埃希菌各1例。臨床使用抗菌藥物(人蒼白桿菌改用左氧氟沙星聯合阿米卡星，銅綠假單胞菌和大腸埃希菌應用美羅培南)治療后，3例患者臨床癥狀緩解，1例感染人蒼白桿菌腦膿腫患者最后因發生腦疝死亡。

表2腦脊液PCR擴增與培養法比較

Table 2Comparison between PCR amplification and culture method of CSF

分組PCR檢測陽性陰性培養法陽性陰性合計病例3157256388對照02002020合計31772583108

2.3PCR檢測時間與最低檢出限PCR檢測時間約6 h，測序結果平均報告時間約48 h，短于培養結果報告時間(細菌平均約72 h，真菌平均約96 h)。PCR檢測大腸埃希菌ATCC 25922的最低檢測限為1.5×101CFU/mL，白假絲酵母菌ATCC 10231為1.5×102CFU/mL。

2.4PCR測序鑒定PCR擴增測序結果與培養鑒定結果的符合率為84.00%(21/25)，包括新生隱球菌5株，鮑曼不動桿菌4株，肺炎克雷伯菌3株，金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌和大腸埃希菌各2株，馬耳他布魯桿菌、溶血葡萄球菌和肺炎鏈球菌各1株。不符合的4例分別為：新生隱球菌測序鑒定為格特隱球菌，羅倫特隱球菌測序鑒定為白假絲酵母菌，鮑曼醋酸鈣不動桿菌復合體測序鑒定為鮑曼不動桿菌，新生隱球菌測序鑒定為新生隱球菌格魯比變種。

3討論

CNS感染的病原菌以往以革蘭陽性菌為主，隨著抗菌藥物的廣泛應用，腦脊液培養的病原菌種類亦在發生變化[6-9]。本組分離的150株菌中革蘭陽性菌占60.00%，革蘭陰性菌占32.00%，真菌占8.00%，共27個種屬，居前5位的細菌分別為鮑曼不動桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌，與報道[6]不同。可能與本研究入選對象多為住院術后顱內感染患者，多已接受過抗菌藥物治療有關。本組CNS感染患者分離病原體最常見的真菌為新生隱球菌和白假絲酵母菌，表明CNS感染病原體種類較多，革蘭陰性細菌上升趨勢明顯，臨床應關注其病原譜的變化，合理選擇抗菌藥物，防止耐藥菌的發生與傳播。

CNS感染加大了臨床治療難度，延長了患者住院時間，并影響預后，因此，早期正確的診斷和及時有效的抗菌治療非常重要。目前，傳統的病原學培養仍是診斷CNS感染的重要手段。本組PCR檢測敏感度(35.23%)高于培養法(28.41%)，同以往研究結果一致[1-3]。本組PCR法和培養法陽性預測值和特異度均為100%，在臨床診斷基礎上PCR或培養出病原體均可明確感染。4例培養陰性者臨床均有感染相關指征，如發熱、頭痛等癥狀，腦脊液渾濁或膿性，腦脊液壓力升高、細胞總數和中性粒細胞數或淋巴細胞數增高，腦脊液葡萄糖和氯化物下降、蛋白升高等；PCR檢測為陽性，測序結果為人蒼白桿菌2例、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌各1例；臨床進行抗菌藥物治療后，3例患者好轉。培養陽性率較低的原因可能為培養所需菌量多、敏感性差，臨床抗菌藥物的應用抑制了細菌生長，標本采集和運送過程等外界因素影響細菌的存活等。Rajesh等[1]研究發現，腦脊液放置2、4 h后培養假陰性比率分別為52.6%和78.9%。本組結果顯示，PCR檢測細菌最低檢出限為1.5×101CFU/mL，真菌為1.5×102CFU/mL，敏感性高于培養法(105/mL)[10]。另外，PCR檢測不受使用抗菌藥物的影響[10]，活菌死菌均可檢測，尤其對于苛養菌、難培養及鑒定的細菌或真菌均能準確檢出，如本研究中苛養菌馬爾他布魯菌。病原學培養緩慢，報告所需時間長。PCR方法縮短了報告時間，在早期診斷方面具有顯著優勢[11-12]。

本組1例真菌培養經VITEK 2 Compact鑒定為新生隱球菌，PCR測序結果為格特隱球菌[13]，可見分子方法較常規方法在區分表型及生化特征相近菌方面更準確[14]。但16S rRNA為所有細菌共有，通用引物PCR擴增時控制細菌污染是關鍵問題。由于PCR檢測的敏感性高，整個檢測過程，包括標本采集、DNA提取、PCR擴增及測序分析等，一旦出現污染，可導致假陽性誤導臨床，因此，必須設置陰性對照。本組所有標準菌株測序結果與GenBank中數據完全符合，雙蒸水擴增結果陰性，說明PCR擴增準確無污染。而PCR法能否成功擴增與樣本模板DNA含量相關，若DNA含量低，可導致假陰性而漏檢，因此，選擇合適的DNA提取方法，并獲得足量的模板DNA是PCR成功的關鍵[2,15]。

總之，細菌/真菌性CNS感染病原菌種類眾多，臨床應關注腦脊液中病原譜的變化。使用通用引物PCR檢測較傳統培養方法更快速、準確、靈敏，在診斷細菌或真菌性CNS感染時可結合多種檢測手段，提高檢測陽性率，為臨床早期診斷、及時治療提供病原學依據。

[參 考 文 獻]

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(本文編輯：周鵬程)

Value of universal primer PCR for diagnosing bacterial and fungal infection of central nervous system

CAOJing-rong1，CHENJing1,2，GAOShi-chao1，CHENDian-dian1，WANGPei-chang1

(1XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China； 2JiangxiHealthVocationalCollege,Nanchang330201,China)

[Abstract]ObjectiveTo understand pathogen spectrum of bacterial and fungal infection of central nervous system (CNS), and evaluate the etiological diagnostic value of universal primer polymerase chain reaction (PCR).MethodsData about patients with suspected or confirmed bacterial and fungal infection of CNS from January 2009 to March 2015 were collected, species of pathogens from cerebrospinal fluid (CSF) were analyzed, DNA from patients’ CSF were performed PCR amplification and sequencing with universal primers of bacterial 16S rRNA and fungal 28S rRNA, PCR detection results were compared with CSF culture during the same period.ResultsA total of 400 patients were with confirmed or suspected bacterial or fungal infection of CNS, 132 of whom were with positive CSF culture.150 pathogenic isolates were detected, including 48 isolates of gram-positive bacteria, 90 gram-negative bacteria, and 12 fungi; the top three isolated bacteria were Acinetobacter baumannii (n=32), coagulase negative staphylococcus (n=16) and Klebsiella pneumoniae (n=13); the most common fungus was Cryptococcus neoformans (n=8). CSF from 88 infected patients and 20 non-infected patients were selected for PCR amplification, the sensitive of PCR amplification assay was higher than the culture method (35.23% [31/88] vs 28.41%[25/88], χ2=4.17，P<0.05). Negative predictive value of PCR amplification assay and culture method were 25.97% and 24.10% respectively, the specificity and positive predictive value of two methods were both 100.00%. The coincidence rate of PCR amplification sequencing and culture result was 84.00%(21/25); the average reporting time of PCR (48 h) was more rapid than that of culture (72 h for bacteria and 96h for fungi).ConclusionPathogens of CNS infections are widely distributed and the main are gram-negative bacteria; universal primer PCR has the characteristics of rapid, high sensitivity, and accuracy, which has a good clinical popularization and application value.

[Key words]central nervous system infection; meningitis; cerebrospinal fluid; intracranial infection; pathogen; universal primer; identification

[中圖分類號]R446.14

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-9638(2016)03-0145-05

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2016.03.001

[作者簡介]曹敬榮(1979-)，女(漢族)，河北省邢臺市人，主治醫師，主要從事臨床微生物檢驗、細菌耐藥性及分子流行病學研究。[通信作者]王培昌E-mail: pcw1905@126.com

[基金項目]首都臨床特色應用研究重點專項課題(Z141107002514012)

[收稿日期]2015-07-20